人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及向成骨成脂分化的實驗研究

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1、人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及向成骨成脂分化的實驗研究：孫國棟，李志忠，王晶，林永新，洪亮，吳波文，焦根龍，邵建立【摘要】　　目的探討并優(yōu)化人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUCMSCs)體外獲取及培養(yǎng)增殖的方法并鑒定；誘導其向成骨細胞和脂肪細胞分化，為其進一步應用奠定基礎。方法用酶消化法分離培養(yǎng)hUCMSCs，通過傳代培養(yǎng)、擴增，倒置光學顯微鏡及原子力顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；MTT法檢測細胞增殖曲線，流式細胞儀檢測免疫表型；體外向成骨、脂肪方向誘導分化，并通過特異性染色鑒定其分化能力。結(jié)果采用酶消化法能有效分離純化hUCMSCs。接種24h，貼壁細胞形態(tài)多為

2、長梭型、多邊形或成纖維細胞樣形態(tài)，大小均一。P3、P7代細胞的生長曲線基本一致，增殖能力強。流式細胞儀分析，第3代細胞強烈表達CD29、CD44、CD105，不表達CD34、CD45和HLADR。經(jīng)成骨誘導分化后4周，堿性磷酸酶染色呈強陽性，茜素紅染色可見明顯鈣結(jié)節(jié)；經(jīng)成脂誘導3周，油紅O染色呈陽性，有明顯的脂滴出現(xiàn)。結(jié)論本實驗建立了一套體外穩(wěn)定培養(yǎng)擴增hUCMSCs的方法。所培養(yǎng)的細胞成分單一、擴增迅速、生物學形狀穩(wěn)定，并能使其在體外誘導向成骨細胞和脂肪細胞分化，有望成為組織工程較為理想的種子細胞?！娟P鍵詞】臍帶；間充質(zhì)干細胞；分化；成骨細胞

3、；脂肪細胞　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishanoptimizedmethodtoisolate,cultureandidentifyhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(hUCMSCs)invitroandinducetheirosteogenicandadipogenicdifferentiation.MethodsThehUCMSCshumanumbilicalcordbydigestioncellsicroscopeandatomicforcemicroscope.The

4、proliferationrateeasuredbyMTTassay.Cellcycleandsurfaceantigenseasuredbyfloetry.Theosteogenicandadipogenicdifferentiationethods.ResultsTheisolationofhUCMSCsbydigestionogeneous.ThesimilargroetryanalysisrevealedthatCD29,CD44andCD105edium,thecellsineralizationpresentedore,liquidv

5、acuolesethodforisolationandpurificationofhUCMSCsfromhumanumbilicalcordhasbeenestablished.Theculturedcellscellsoftissueengineering.　　KEYSCs);differentiation;osteocyte;adipocyte　　人臍帶間充質(zhì)干細胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞,具有豐富，易于采集、保存和運輸，無異

6、體排斥，避免倫理爭議等諸多優(yōu)點。大量研究表明，hUCMSCs具有多向分化潛能，在體內(nèi)外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經(jīng)元細胞等[1]。因此，其在組織工程、造血干細胞移植以及基因治療等領域具有廣闊的應用前景，成為干細胞研究的熱點。本研究探討hUCMSCs的體外分離、純化、擴增以及定向分化條件，為hUCMSCs在組織工程中的進一步應用提供理論依據(jù)和技術支持?！　?材料與方法　　1.1材料　?、蛐湍z原酶(GIBCO，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基(HYCLONE，美國)；胎牛血清(HYCLONE，美國)；地塞米松、吲哚美

7、辛、胰島素、β甘油磷酸鈉和抗壞血酸(Sigma，美國)。恒溫恒濕培養(yǎng)箱(SHELLAB，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；原子力顯微鏡(THERMO，美國)；流式細胞儀(BectonDickinson，美國)；恒溫搖床(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管(Corning，美國)?！　?.2方法　　1.2.1hUCMSCs的分離與培養(yǎng)　　從手術臺取正常足月產(chǎn)健康嬰兒臍帶組織(根據(jù)醫(yī)院規(guī)定并經(jīng)家屬同意)，浸泡于DMEM中。超凈臺內(nèi)取出臍帶，DHanks平衡液充分洗滌殘留的血液，去除臍靜脈

8、、臍動脈及臍帶外膜，剝離EM，在37℃恒溫震蕩儀內(nèi)消化，直至EM反復吹打稀釋，1500r/min離心10min，棄上清液，用含150mL