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1、山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建摘要：本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增山臘梅幾丁質(zhì)酶基因，對(duì)幾丁質(zhì)酶基因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)成功構(gòu)建植物表達(dá)載體，為植物幾丁質(zhì)酶基因功能的研究提供理論基礎(chǔ)。中國(guó)1/vie 關(guān)鍵詞：山臘梅；幾丁質(zhì)酶；基因克??；植物表達(dá)載體 中圖分類號(hào)：Q344.13文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.11974/nyyjs.20170132003 幾丁質(zhì)酶不僅在植物抗真菌病害中起著重要的作用，而且在植物發(fā)育、生物固氮及抗逆等方面都發(fā)揮關(guān)鍵作用。特別是在病蟲(chóng)害防治方面，采用生物技術(shù)的手段改良植物的抗病蟲(chóng)害和抗逆的研究越來(lái)越多，且已取得了較為明顯的成果。目前已先后
2、從小擬南芥、大白菜、菜豆、野生香蕉、紫花苜蓿、中國(guó)水仙等植物中克隆獲得幾丁質(zhì)酶基因。隨著人們對(duì)其作用、特性、表達(dá)調(diào)控及轉(zhuǎn)基因的深入研究，使幾丁質(zhì)酶基因成為植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中重要的研究對(duì)象及作物抗真菌病害基因工程的研究熱點(diǎn)?！ ¤b于幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病及抗逆方面的作用，本研究以抗病蟲(chóng)害及抗逆性較強(qiáng)的山臘梅為材料，通過(guò)RT-PCR的方法首次克隆得到山臘梅中的幾丁質(zhì)酶基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步構(gòu)建植物表達(dá)載體。研究結(jié)果豐富了植物幾丁質(zhì)酶基因的研究，同時(shí)為通過(guò)植物基因工程手段提高植物的抗病蟲(chóng)害及抗逆功能研究提供理論基礎(chǔ)?！ ?材料與方法 1.1材料 植物材料：山臘梅種子購(gòu)自源茂
3、種業(yè)，土培至長(zhǎng)出幼苗（約2個(gè)月），取幼嫩葉片，5mm水楊酸處理4h后立即用液氮固定，置-80℃冰箱備用?！ ≈参锉磉_(dá)載體：pGFPGUSPlus由吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院提供?！ ≈饕噭篢rizol試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司?！ ?.2方法 1.2.1山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上檢索到臘梅幾丁質(zhì)酶基因（FJ749130），設(shè)計(jì)特異性引物。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增?！ CR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠電泳檢測(cè)，利用產(chǎn)物回收試劑盒純化目的片段。將純化的PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序?！ ?.2.2
4、山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的序列分析 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，如幾丁質(zhì)酶基因序列同源性比對(duì)、蛋白保守域分析，進(jìn)一步使用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)?！ ?.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將含有植物表達(dá)載體的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，堿裂法提取質(zhì)粒載體。將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體同時(shí)用XbaI和SacI進(jìn)行酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收酶切后的目的基因和質(zhì)粒。將目的基因和酶切質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，堿法提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定?！ ?結(jié)果與分析 2.1山臘梅幾丁質(zhì)酶基因的克隆 以臘梅cDNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)
5、增獲得一條約1000bp的特異條帶（圖1），進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序。 2.2山臘梅幾丁質(zhì)酶基因序列的生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果分析表明山臘梅幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)為939bp，編碼312個(gè)氨基酸。蛋白分子量為32.9KD。核酸序列同源比對(duì)結(jié)果表明，山臘梅幾丁質(zhì)酶基因與已公布的臘梅幾丁質(zhì)酶基因（FJ560717及FJ749130）的同源性高達(dá)98%，與蒺藜苜蓿Medicagotrtmcatula（Y10373）、馬鈴薯Solanumtuberosum（NM_001288193）、水稻Oryzasativa（XM_015788082）、辣椒Capsicumannuum（FJ596176）的同源性均為75%，與
6、紫花苜蓿Medicagosativa（AY804254）的同源性為73%，與大麥Hordeumvulgare（AK358661）的同源性為65%。 幾丁質(zhì)酶蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明（圖2），其編碼的肽鏈具有典型的糖苷水解酶19家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中具有3個(gè)特征性的催化位點(diǎn)及6個(gè)推斷的幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；該結(jié)構(gòu)域與類溶菌酶超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域類似，推測(cè)該酶兼具溶菌酶活性?！ 「鶕?jù)幾丁質(zhì)酶核酸序列比對(duì)的結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站上檢索到11種不同植物的幾丁質(zhì)酶基因核酸序列，采用Neighbor_joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明（見(jiàn)圖3），山臘梅（ChimonanthusnitensOli
7、v.）與臘梅（Chimonanthuspraecox（Linn.）Link）聚類在同一個(gè)單源分支上，親緣關(guān)系最近；其次是外圍枝的馬鈴薯、菜豆、辣椒、水稻等。與野生香蕉的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)?！ ?.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建 菌液PCR?證陽(yáng)性克隆子，進(jìn)一步提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明（如圖4），山臘梅幾丁質(zhì)酶基因已成功插入到表達(dá)載體pGFPGUSPlus中。 3討論 隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)的不斷
