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1、蒙藥冷蒿的遺傳多樣性隨機(jī)引物多態(tài)性分析論文劉越潘寧，黃怡鶴，溫婧，周廉【摘要】目的研究?jī)?nèi)蒙古通遼地區(qū)蒙藥冷蒿的遺傳特異性及通遼、呼和浩特、錫林郭勒3個(gè)不同地區(qū)蒙藥冷蒿的遺傳多樣性。方法采用隨機(jī)引物多態(tài)性(RAPD)方法，從17組RAPD引物中篩選出13組條帶清晰、多態(tài)性明顯并且重復(fù)性好的引物用于實(shí)驗(yàn)，并利用Popgen32和NTSYS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與聚類分析。結(jié)果①13組引物共產(chǎn)生的209條帶中，有201條多態(tài)性帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)96.17%。②3個(gè)地區(qū)蒙藥冷蒿Ht=0.2381.freelisiafrigidainTong
2、liaopopulationandthreedifferentregionsofInnerMongolia(Tongliao,Hohhot,Xilingol).Methods13groupsofprimersorphicandreproduciblebandsthe17groupsofprimersbyrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)method.Thebandsproducedbythe13groupsofprimersersgenerated209bands,including201po
3、lymorphicbands.Thepercentageofpolymorphiclociationisiafrigidapopulationongpopulations(Dst)ongpopulations(Gst)thegeicvariationongpopulations.Keyisiafrigidpopulation;ImprovedCTAB;RAPD;Geicdiversity蒙藥冷蒿Atremisiafrigida(蒙語(yǔ)：阿給)，又名小白蒿、菟毛蒿，菊科蒿屬的小灌木，是蒙醫(yī)的常用藥，主要分布在內(nèi)蒙古1～3。近年來(lái)，隨
4、著中藥材標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)一步深入，為提高中藥質(zhì)量和臨床效果，中藥材的道地性的研究越來(lái)越受到重視4～6。但對(duì)民族藥的道地性研究甚少。長(zhǎng)期以來(lái)，蒙藥冷蒿一直在民間用于出血疾病的治療7。研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地來(lái)源的蒙藥冷蒿制炭后止血效果差異顯著，而且來(lái)自荒漠草原的蒙藥冷蒿制炭后活性成分的含量偏高。目前，冷蒿藥材來(lái)源為野生冷蒿，隨著荒漠化的進(jìn)程，以及藥材的大量開(kāi)采，將使冷蒿變成瀕危物種。為了避免野生藥用植物的枯竭，勢(shì)必要進(jìn)行藥材的規(guī)范化栽培種植(GAP)，對(duì)冷蒿遺傳背景的分析，不但可以從遺傳學(xué)角度觀察引起冷蒿質(zhì)量變異的原因，也可以為冷蒿栽培種植提供
5、理論指導(dǎo)。在PCR基礎(chǔ)上建立起來(lái)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)，以其技術(shù)簡(jiǎn)單易行，分析速度快，成本低，不用進(jìn)行DNA克隆、southern雜交等復(fù)雜程序的優(yōu)點(diǎn)，特別適合于遺傳背景不清楚的材料的研究，在中藥材鑒定與遺傳多樣性研究中應(yīng)用廣泛8～10。本實(shí)驗(yàn)采用RAPD方法，考察冷蒿的遺傳結(jié)構(gòu)，探討冷蒿止血活性成分變異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。1材料2007-11分別在呼和浩特、錫林郭勒盟當(dāng)?shù)厥占漭锔伤幉?2008-09在內(nèi)蒙古通遼市奈曼旗采集冷蒿植株，并用冰塊冷凍保存。3個(gè)
6、冷蒿群體編號(hào)見(jiàn)表1，群體間空間距離大于500km。2方法2.1基因組DNA的提取與測(cè)定基因組DNA采用改進(jìn)的CTAB法11提取。DNA大小及其完整性采用標(biāo)準(zhǔn)濃度的λDNA/HindⅢ檢測(cè)，采用SAM3000微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定A260、A280及A230，據(jù)此推知各樣本總DNA的含量。2.2RAPD引物的篩選參照王靜12以及本實(shí)驗(yàn)室11的方法，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，對(duì)單一DNA樣品多引物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。在Bio-RADGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。最后，篩選出可產(chǎn)生多態(tài)性且重復(fù)性好的引物組合。表1材
7、料來(lái)源Tongliao)E122.16500350～450沙地31株H呼和浩特N40.82(Hohhot)E111.81580335～534.6荒漠草原藥材L錫林郭勒N43.95(Xilingol)E115.46790295典型草原藥材2.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，RAPD為顯性標(biāo)記，同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳中遷移率相同的條帶被認(rèn)為是同源性的，屬于同一位點(diǎn)的條帶按清晰可見(jiàn)的強(qiáng)帶或反復(fù)出現(xiàn)的弱帶記為1，無(wú)帶記為0，形成二元數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)“0-1”原始矩陣，用Popgen32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比率(P)、Nei's遺傳多樣
8、性指數(shù)(h*)、Shannon信息指數(shù)(I*)、總?cè)后w的基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間基因多樣性(Dst)、基因分化系數(shù)(Gst)、遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)。利用NTSYS軟件進(jìn)行各品種間UPGMA(unethodeticmean)
