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1、龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚缺損的作用劉愛軍朱永紅趙鐘祥張立群杜標炎鄺棗園李彩霞易華【摘要】 [目的]觀察龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚缺損創(chuàng)面的促進作用。[方法]將人成纖維細胞種植入膠原海綿，人角質形成細胞種植在表層，構建組織工程皮膚，并移植入裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面;實驗動物隨機分為4組，選用"活血圣藥"龍血竭于移植后2d分別進行創(chuàng)面外敷、單純口服、創(chuàng)面外敷+口服治療，并設空白對照組。組織工程皮膚移植后9d取材檢測，觀察創(chuàng)面局部表皮厚度、真皮層中層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原蛋白的表達及毛細血管增生情況。[結果]龍血竭能促進組織工程皮膚移植后表皮的
2、發(fā)育及真皮層中毛細血管的增生,增強Ln、Ⅰ型膠原蛋白的分泌，龍血竭外敷+口服組效果最佳。[結論]龍血竭對組織工程皮膚修復皮膚創(chuàng)面有促進作用?！娟P鍵詞】龍血竭/藥理學皮膚缺損/中西醫(yī)結合療法皮膚移植組織工程皮膚/病理學細胞培養(yǎng) 大面積的皮膚缺損需要皮膚移植進行修復，皮源不足是最大的問題，許多患者往往因難以實現及時的救護，而導致感染、多器官功能衰竭等嚴重并發(fā)癥甚至死亡。組織工程皮膚是利用來源于自體或異體的皮膚細胞，與適宜的真皮支架復合，在體外構建而成的皮膚類似物，將其移植入皮膚缺損創(chuàng)面，修復缺損的皮膚,為解決皮膚移植中的皮源不足問題提供了光明前
3、景。但目前組織工程皮膚移植后存在表皮層薄、血管化進程慢等問題，導致移植成功率低[1]。 祖國傳統(tǒng)醫(yī)學在治療皮膚創(chuàng)傷方面有著悠久的歷史，"生肌法"是中醫(yī)藥治療皮膚創(chuàng)傷的一項重要治則，生肌中藥通過"收斂止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修復缺損的皮膚。本研究將構建的組織工程皮膚移植后，利用活血圣藥龍血竭作用于移植處，觀察創(chuàng)面微環(huán)境的變化，探討利用生肌中藥促進組織工程皮膚修復創(chuàng)面的可能性，現報道如下。 1材料與方法 1.1主要材料高糖?DMEM及低糖?DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灝洋生物制品科技有限公司);25cm2
4、塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型膠原酶(均為Sigma公司);其他試劑均為國產分析純。龍血竭購自廣州市杏園春大藥房;幼兒包皮取自中山一院兒外科無菌切除標本(病人家屬知情);人角質形成細胞購自中山大學北校區(qū)實驗動物中心;膠原海綿購自廣州市創(chuàng)爾生物技術有限公司?！ ?.2實驗動物SPF級裸鼠，雌雄不拘，體質量約20g，購自本校實驗動物中心，合格證號：SCXK粵2003?0001，粵監(jiān)證字2007A015?！ ?.3免疫熒光試劑及儀器Ⅰ抗層粘連蛋白(Ln)(博士得生物試劑公司);Ⅰ型膠原(Sigma公司);Ⅱ抗為紅色熒光探針(Cy3
5、)標記的山羊抗小鼠IgG(IgG?Cy3)，核標記物為二脒基苯基吲哚(DAPI)，均購自Sigma公司;IX71奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本)。 1.4實驗方法 1.4.1人皮膚細胞的培養(yǎng)取無菌切除術后幼兒包皮，于超凈工作臺上用含青霉素2×105U/L、鏈霉素200mg/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，盡可能剔除皮下組織，剪成約2mm×2mm小塊，置于1g/LⅡ型膠原酶消化液中消化過夜(4℃、約18h)，分離表皮和真皮。將真皮剪碎，然后轉移至2.5g/L胰蛋白酶中約15min，以含體積分數10%FBS的高糖?DMEM培養(yǎng)液終止消化，1
6、000r/min離心3min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，以含體積分數10%FBS的高糖?DMEM培養(yǎng)液分離培養(yǎng)人包皮成纖維細胞。角質形成細胞以含體積分數10%FBS的低糖?DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)傳代?！ ?.4.2組織工程皮膚的構建將無菌的膠原海綿剪成1cm×1cm×0.2cm小塊，放入無菌24孔板內，取第3～5代人包皮成纖維細胞，按1×105個/cm2將細胞種植于膠原海綿兩面，體積分數5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)3～4h。將人角質形成細胞以1×105個/cm2密度接種于單面膠原海綿，無菌培養(yǎng)3～4h?！ ?.4.3組織工程皮膚的移
7、植SPF級裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg劑量)，固定于手術臺上，嚴格消毒后，沿背部正中線左右距脊柱約0.5cm處皮膚呈"C"形切開，形成皮瓣，分離皮下組織至深筋膜，暴露肌層，切口大小約1cm2。將體外構建的組織工程皮膚覆蓋到全層皮膚缺損的創(chuàng)面，再用無菌凡士林紗布覆蓋，單針縫線固定皮瓣于正常皮膚上，無菌紗布包扎。術后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。單籠飼養(yǎng)?！ ?.4.4實驗分組實驗動物隨機分為4組，每組4只，分為龍血竭外敷組(隔天換藥)、內服(按70mg·kg-1·d-1劑量灌胃)組、外敷+內服組，不用藥者為空白對照組。于術
8、后9d取材檢測，單籠飼養(yǎng)?！ ?.4.5免疫熒光檢測術后9d取材，連同周邊正常皮膚剪去稍許，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中
