幾種酵母轉(zhuǎn)化方法

《幾種酵母轉(zhuǎn)化方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、幾種酵母轉(zhuǎn)化方法酵母轉(zhuǎn)化原理：像釀酒酵母,線性化的轉(zhuǎn)化DNA和Pichiapastoris基因組的同源區(qū)域發(fā)生同源重組,使得線性化DNA產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子（Creggetal.,1985;Creggetal.,1989）.這樣的整合方式顯示極強(qiáng)的穩(wěn)定性,即使多拷貝轉(zhuǎn)化子在沒有選擇壓力的情況下也很穩(wěn)定.單交換事件（插入）比雙交換事件（置換）發(fā)生幾率更大.單插入事件中約發(fā)生1-10%概率的多插入事件.電轉(zhuǎn)化注意點(diǎn)：一、制備感受態(tài)的菌液收集時(shí)間：1、準(zhǔn)確測定OD值：OD在1.2～1.5之間。1）為了準(zhǔn)確測定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測定（1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線

2、性關(guān)系）。每個(gè)倍數(shù)做3－5個(gè)重復(fù)，應(yīng)該可以大致推斷OD值是否準(zhǔn)確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數(shù)不夠！2）OD值是否測準(zhǔn)也可以這樣估算：OD600為40左右時(shí)，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重將相應(yīng)下降。2、75ml的菌，經(jīng)18h左右的培養(yǎng)，最后sorbital洗滌完畢后，50ml離心管里所剩菌體特別濃，需要1mlsorbitol才可溶解為糊狀。正常培養(yǎng)的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態(tài)也用1ml稀釋的，沒那么粘稠?？梢钥纯唇档团囵B(yǎng)溫度（27攝氏度）或縮短培養(yǎng)時(shí)間（12h）。3、甚至不用轉(zhuǎn)接

3、,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過夜，效果也很好二、制備感受態(tài)的菌液量如果只轉(zhuǎn)一個(gè)樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養(yǎng)液如果OD值正常的話夠做10管感受態(tài)的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態(tài)，每一步的離心時(shí)間30秒就行。整個(gè)流程時(shí)間短，制備好的感受態(tài)用來做轉(zhuǎn)化的效率很高。山梨醇離心，洗滌的過程之后的重懸的時(shí)候注意濃度，不要過于粘稠和稀釋。三、感受態(tài)的保存感受態(tài)細(xì)胞做好后由于電轉(zhuǎn)化杯還沒有處理好等原因，在冰上放幾個(gè)小時(shí)再做可能有一定的影響，盡量馬上制備馬上轉(zhuǎn)化。如果感受態(tài)細(xì)胞要保存，不需要加甘油，一般80ulEP管分

4、裝，-70或-80攝氏度保存。另附：酵母GS115點(diǎn)種分離純化接種GS115于5mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布YPD平板，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，用YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。四、電轉(zhuǎn)化注意點(diǎn)：1、感受態(tài)做好后，最后一次吸出sorbital時(shí)，不是直接倒調(diào)的，而是用毛細(xì)管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。2、最后用毛細(xì)管取出100ul出來，加入質(zhì)粒，混勻?。ㄅ铝坎粔?，吸得很多，電轉(zhuǎn)時(shí)效果反而不好。）3、電轉(zhuǎn)杯清潔處理:一般先沖洗，洗凈；然后浸泡在7

5、5%的乙醇中；使用前我們都是放在超凈臺上，開啟紫外，邊吹風(fēng)晾干，邊進(jìn)行紫外照射。電轉(zhuǎn)杯的新包裝或重復(fù)使用可能對轉(zhuǎn)化率有一定的影響。4、電擊的時(shí)候，電壓數(shù)以及電擊時(shí)間可以摸索一下，適當(dāng)增加電壓或者延長電擊時(shí)間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進(jìn)行，電擊時(shí)間可以減少一點(diǎn)，設(shè)置為5ms左右，電擊之后馬上加入預(yù)冷的山梨醇溶液，轉(zhuǎn)移至EP管，30度靜止培養(yǎng)1h。如果菌體懸液濃度比較大的時(shí)候，在制備感受態(tài)的時(shí)候要留心一下操作中的問題了。5、電擊之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度搖床低速培養(yǎng)1h，再涂板。6、注意的是處

6、理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨(dú)于-20度保存，可配成100倍的貯備液。7、轉(zhuǎn)化后1ml用sorbitol重懸的細(xì)胞懸液不能全部涂在一塊板子上，按標(biāo)準(zhǔn)程序制作的感受態(tài)一般3塊左右可能比較合適，以干燥后看見一薄層淡淡的白色為宜。轉(zhuǎn)化子會(huì)在白色的薄層上長出圓韻、飽滿的大菌落的。五、轉(zhuǎn)化試劑和培養(yǎng)基的正確準(zhǔn)備方法1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時(shí)候吸收效果會(huì)好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長。2、YNB42度水浴一會(huì)，然后過濾除菌，YNB是加到培養(yǎng)基里面的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關(guān)系不是太大

7、）。3、山梨醇，以及無菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中4、一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ulddH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于100個(gè)克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。5個(gè)電轉(zhuǎn)化方案方法一：高效1.收集菌體取1mlGS115過夜培養(yǎng)物（OD約6-10）分裝到1.5mlEP管中，4℃、10000g離心1min，棄上清