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《畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選菌體的準(zhǔn)備:1.挑取酵母單菌落,接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中,30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜;2.取100-500μl(≤1:100)的培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中,28~30℃、250-300r/min培養(yǎng)過夜(約20h),至OD600達(dá)到1.3~1.5;3.將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃,1500g離心5min,用50ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸;4.按步驟3離心,用25ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸5.按步驟3離心,用2-5ml,1M的冰預(yù)冷山梨醇溶液將菌體沉淀重懸;6.按步驟3離心,
2、用160μl的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸,其終體積約為240ul;備注:可將其分裝為80μl一份的包裝-70冷凍起來,2周之內(nèi)使用,但會影響其轉(zhuǎn)化效率。比如常見的pPIC9K的載體轉(zhuǎn)GS115一般先用MD平板初篩,然后長出的克隆子可以挑到不同濃度的含G418抗性的YPD平板上篩選高拷貝。對正確篩選出的單菌落接YPD小瓶搖活后,轉(zhuǎn)大瓶BMGY搖瓶發(fā)酵。一般對于甲醇誘導(dǎo)菌株,搖瓶一天左右后開始補(bǔ)加甲醇,就類似BMMY的功能了。üKM71比GS115生長的要慢。畢赤酵母都應(yīng)該是白色菌落的ü對于LOX家族蛋白的表達(dá),可嘗試在酵母培養(yǎng)基中加入Cu2+離子,提高表達(dá)量和蛋
3、白活性?菌種保存:挑單克隆到Y(jié)PD中培養(yǎng)18-24h,然后取菌液以1:1加入30%滅菌甘油,-80oCul/管凍存(一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,約20ulddH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于100個克隆每ugDNA。建議你不要用膠回收kit,回收的DNA可能還有鹽,導(dǎo)致電擊時放電時間很短。乙醇沉淀主要步驟如下:1)酶切體系(80ul)中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5.2NaAC,混勻2)-20℃20分鐘沉淀3)13200rpm,20min,離心后棄上清4)75%乙醇300ul輕輕洗,同上離心5min,棄上清5)37度烘箱至
4、無乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯脫u床的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹)。6)20ulddH2O重溶)電擊轉(zhuǎn)化:8.將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μlTE溶液中,與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻,轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中;9.將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min;10.根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料,參考其他文獻(xiàn)及多次摸索,確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù),按優(yōu)化的參數(shù),進(jìn)行電擊;11.電擊完畢后,馬上加入1ml1M的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中;(置于30度搖床低速培養(yǎng)1h,再涂板)12.將菌體懸液涂布于MD平板上,每200~600μl涂布一塊平板;13.將平板置于30℃倒
5、置培養(yǎng),直至單個菌落出現(xiàn)(3-4天)。推薦:電壓1.5kV;電容25μF;電阻200Ω。電擊時間為4~10msec。Pichia酵母表達(dá)直接PCR鑒定重組子的方法1.平板上的菌落長到肉眼可見時(約12小時);2.取1ml酵母懸液4000rmp離心,pbs重懸,煮沸5mins,放到冰上5mins,直接就可以用做pcr的模板了3.將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好,并分裝。3.用滅菌的牙簽挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR擴(kuò)增,利用5’AOX1和3’AOX1引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR復(fù)篩,同時檢測基因插入(如果重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到Pichiapastoris基因組
6、,則會擴(kuò)增到兩條帶,一條為2.2kb(KM71為3.6kb)宿主茵AOXI基因,另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號肽序列的片段。)Each50μlaliquotofcompetentPichiacellswith3μglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實驗Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourtotalflaskvolume.1.
7、挑選一單菌落,置于裝有50mlMGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,于28-30°C/250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h);2.室溫下1500~3000g離心5min,收集菌體,用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的MM,BMM或BMMY重懸菌體(約2.5~5ml);3.將步驟2所得的菌液置于100ml的搖瓶中,用雙層紗布或粗棉布封口,放置于28-30°C/250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長;4.每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5~1.0%;5.按時間點分