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《畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選菌體的準(zhǔn)備：1.挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜；2.取100-500μl（≤1:100）的培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，28~30℃、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜(約20h)，至OD600達(dá)到1.3~1.5；3.將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用50ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；4.按步驟3離心，用25ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸5.按步驟3離心，用2-5ml，1M的冰預(yù)冷山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；6.按步驟3
2、離心，用160μl的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為240ul；備注：可將其分裝為80μl一份的包裝-70冷凍起來(lái)，2周之內(nèi)使用，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。比如常見(jiàn)的pPIC9K的載體轉(zhuǎn)GS115一般先用MD平板初篩，然后長(zhǎng)出的克隆子可以挑到不同濃度的含G418抗性的YPD平板上篩選高拷貝。對(duì)正確篩選出的單菌落接YPD小瓶搖活后，轉(zhuǎn)大瓶BMGY搖瓶發(fā)酵。一般對(duì)于甲醇誘導(dǎo)菌株，搖瓶一天左右后開(kāi)始補(bǔ)加甲醇，就類似BMMY的功能了。üKM71比GS115生長(zhǎng)的要慢。畢赤酵母都應(yīng)該是白色菌落的ü對(duì)于LOX家族蛋白的表達(dá)，可嘗試在酵母培養(yǎng)基中加入Cu2+離子，提
3、高表達(dá)量和蛋白活性?菌種保存：挑單克隆到Y(jié)PD中培養(yǎng)18-24h,然后取菌液以1:1加入30%滅菌甘油，-80oCul/管凍存（一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ulddH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于100個(gè)克隆每ugDNA。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。乙醇沉淀主要步驟如下：1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無(wú)水乙醇加1/10體積的PH5.2NaAC，混勻2)-20℃20分鐘沉淀3)13200rpm，20min，離心后棄上清4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min，棄上
4、清5)37度烘箱至無(wú)乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯脫u床的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹）。6)20ulddH2O重溶）電擊轉(zhuǎn)化：8.將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μlTE溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；9.將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；10.根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；11.電擊完畢后，馬上加入1ml1M的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；（置于30度搖床低速培養(yǎng)1h，再涂板）12.將菌體懸液涂布于MD平板上，每200~600μl涂布一塊平板；
5、13.將平板置于30℃倒置培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)（3-4天）。推薦：電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時(shí)間為4～10msec。Pichia酵母表達(dá)直接PCR鑒定重組子的方法1.平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)（約12小時(shí)）；2.取1ml酵母懸液4000rmp離心，pbs重懸，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了3.將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。3.用滅菌的牙簽挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR擴(kuò)增，利用5’AOX1和3’AOX1引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR復(fù)篩,同時(shí)檢測(cè)基因插入(如果重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到Pi
6、chiapastoris基因組，則會(huì)擴(kuò)增到兩條帶，一條為2.2kb（KM71為3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號(hào)肽序列的片段。)Each50μlaliquotofcompetentPichiacellswith3μglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourt
7、otalflaskvolume.1.挑選一單菌落，置于裝有50mlMGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于28-30°C/250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(~16-18h)；2.室溫下1500~3000g離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的MM,BMM或BMMY重懸菌體（約2.5~5ml）；3.將步驟2所得的菌液置于100ml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；4.每24h向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0%；5.按時(shí)間點(diǎn)分
