蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法

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1、六、蛋白質(zhì)含量定量法一、Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并

2、且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25-100μg）在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)(5-25μg)在755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin-酚試劑法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶??2只；移液管??1毫升4支，5毫升2支；

3、721型分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)?Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml?0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶于100m1?1％酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50ml與后者lml混合?；旌虾?日內(nèi)使用有效。(2)Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸餾水、50ml?85％磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h?；亓魍戤?，再加150

4、g硫酸鋰、50ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后定容到1000ml。過(guò)濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標(biāo)定該試劑的酸度，一般為2mol／L左右(由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察)。使用時(shí)適當(dāng)稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmol／L酸。(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱(chēng)取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)

5、確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。(4)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！緦?shí)驗(yàn)操作】1.?繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表分別加入各試劑試劑??????????管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)0.00.10.20.30.40.50.6蒸餾水(ml)1.00.90.80.70.60.50.4Fo1in-酚試劑甲(ml)5555555搖勻，室溫下放置10分鐘Fo1in-酚試劑乙(ml)??111?1111各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在5

6、00nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值。???【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。二、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】?凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的

7、含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。?當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過(guò)程通常稱(chēng)為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度

8、降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。【實(shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材微量凱氏定氮儀??1套；50ml凱氏燒瓶??4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠2.試驗(yàn)試劑(1)?濃硫酸；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸