最新蛋白質(zhì)的定量測定方法教學(xué)講義ppt課件.ppt

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1、蛋白質(zhì)的定量測定方法一、Folin酚試劑法(Lowry法)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的方法和操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。【實(shí)驗(yàn)原理】該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，

2、藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25100μg）在500nm波長處進(jìn)行測定，含量低時(shí)(525μg)在755nm波長處進(jìn)行測定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。二、紫外吸收法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握紫外分光光度計(jì)的操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)

3、中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡便，測定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材試管及試管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mg／mL的酪蛋白溶液。(2)樣品溶液：配制約0.5mg/mL的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。

4、【實(shí)驗(yàn)操作】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管按下列各表加入各試劑：試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于280nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測定未知樣品取樣品溶液4毫升,加蒸餾水4mL混勻，在280nm下測定其光密度值。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。三、微量凱氏定氮法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】凱氏定氮法用于測定有機(jī)物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測定樣品中

5、蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度

6、為止。根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材微量凱氏定氮儀1套；50mL凱氏燒瓶4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠2.試驗(yàn)試劑(1)濃硫酸；30％氫氧化鈉溶液；2％硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液(0.01mol／L)。(2)粉末硫酸鉀—硫酸銅混合物：K2SO4與CuSO4?5H2O以3：1配比研磨混合。(3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50mL0.1％甲烯藍(lán)乙醇溶液與200mL

7、0.1％甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。(4)樣品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作為樣品。【實(shí)驗(yàn)操作】1.安裝凱氏定氮儀。2.消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品1mL，催化劑(K2SO4CuSO4?5H2O)200mg，濃硫酸5mL。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1mL蒸餾水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照。在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行消化。在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)

8、火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫?！緦?shí)驗(yàn)操作】3.蒸餾：(1)蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸餾水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝