核酸的分離與純化

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1、核酸的分離與純化基本知識(shí)回顧核酸(nucleicacid)：以核苷酸為基本組成單位的生物信息大分子具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)DNA重要的功能天然存在的核酸信息的載體RNA信息的儲(chǔ)存、傳遞與表達(dá)基本知識(shí)回顧DNA模式圖第一節(jié)核酸分離與純化的設(shè)計(jì)與原則DNA組成：染色體DNA、細(xì)胞器DNA、質(zhì)粒DNA。分子總長(zhǎng)隨生物進(jìn)化程度而增長(zhǎng)RNA分子比DNA分子要小的多。功能多樣性種類、大小、結(jié)構(gòu)都具多樣性簡(jiǎn)述DNA與RNA的區(qū)別DNA與RNA性質(zhì)上的差異決定了兩者的最適分離與純化的條件是不同的。一、材料與方法的選擇材料與方法的選擇臨床標(biāo)本

2、繁多：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、產(chǎn)量、純度和濃度可能有不同的要求，還需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本，在不影響核酸質(zhì)量的情況下，應(yīng)選擇完全無(wú)毒的試劑與方案。選擇原則一是保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性二是盡量排隊(duì)其它分子的污染，保證樣品的純度。保持核酸的完整性首先，應(yīng)盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞（pH，高溫）其次，對(duì)無(wú)法避免的有害因素，應(yīng)采取多種措施，盡量減輕各種有害因素對(duì)核酸的破壞（提取時(shí)間、DNA酶、RNA酶等）。核酸的釋放DNA與RNA均位于細(xì)胞內(nèi)，因此核酸分離與純化的第一步就

3、是破碎細(xì)胞、釋放核酸。機(jī)械法液體剪切法細(xì)胞的破碎方法固體剪切法非機(jī)械法干燥法溶胞法二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)機(jī)械法主要危害高分子的線性DNA，此法不適全于染色體DNA的分離與純化。（采用適宜的化學(xué)與酶能有效的裂解細(xì)胞，方法溫和，能保證較高的得率和保持核酸的完整性）核酸的分離與純化：利用核酸與其它物質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)上的差異設(shè)計(jì)有效方案，才能使核酸得以分離。細(xì)胞定位與組織分布上的差異核酸與其它物質(zhì)的差異：物理化學(xué)性質(zhì)上的不同各自獨(dú)特的生物學(xué)特性二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)續(xù)復(fù)雜樣品核酸分子直接提取核酸分子去除污染物非核酸的大分子污染物

4、非需要的核酸分子對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響的溶液與試劑核酸分離與純化簡(jiǎn)易圖核酸的濃縮、沉淀與洗滌核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過(guò)程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會(huì)下降二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)續(xù)對(duì)核酸進(jìn)行濃縮沉淀是核酸濃縮最常用的方法（加入一定濃度的鹽類后屏蔽磷酸基團(tuán)，用有機(jī)溶劑如乙醇、異丙醇沉淀核酸）核酸沉淀往往含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除核酸的鑒定1.濃度鑒定：可通過(guò)紫外分光光度法與熒光光度法進(jìn)行。紫外分光光度法：原理：核酸分子成分中的堿基具有一定的紫外線吸收特性。核酸的最大吸收波長(zhǎng)為26

5、0nm，溶液中核酸的濃度與溶液在260nm紫外線下的吸光度（修正參數(shù)：A260－A310）成正比。靈敏度：0.25ug/ml熒光光度法：原理：核酸的熒光染料溴化乙錠（EB）嵌入堿基平面后，使本身無(wú)熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出檢紅色的熒光，且熒光強(qiáng)度積分與核酸含量呈正比。靈敏度：1-5ng三、鑒定與保存2.純度鑒定：紫外分光光度法DNA：在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8蛋白質(zhì)（280nm）與酚（270nm）使比值下降RNA（260nm）使比值升高RNA：在TE緩沖液中，純RNA的A260/A2

6、80比值為2.0，但由于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不同，其讀數(shù)可能在1.8-2.1之間波動(dòng)。鑒定RNA純度所用溶液的pH會(huì)影響A260/A280讀數(shù)。三、鑒定與保存2.純度鑒定：熒光光度法用EB示蹤，進(jìn)行核酸電泳：DNA分子電泳遷移率低；總RNA（三條帶）：23SrRNA28SrRNA16SrRNA18SrRNA5SrRNA+tRNA5SrRNA+5.8SrRNA+tRNA三、鑒定與保存原核生物真核生物3.完整性鑒定(1)凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果可用于判定核酸的完整性。DNA：若有降解的小分子DNA，

7、電泳有脫尾RNA：三個(gè)條帶熒光強(qiáng)度積分應(yīng)呈特定的比值。(2)其它方法：三、鑒定與保存核酸的保存DNA保存：DNA溶于TE緩沖液（pH8.0）中在-70度可以儲(chǔ)存數(shù)年；EDTA螯合二價(jià)金屬離子，可以抑制DNA酶的活性；在DNA樣品中加入少量氯仿，可以有效避免細(xì)菌與核酸的污染小量分裝保存三、鑒定與保存核酸的保存RNA保存1.可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水中,在-70度至-80度保存2.若以焦炭酸二乙酯水（DEPC）溶解RNA或在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白或氧釩核糖核苷復(fù)合物（VRC)，可延長(zhǎng)保存時(shí)間3

8、.RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去離子甲酰胺溶液，可在-20度長(zhǎng)期保存4.小量分裝保存三、鑒定與保存雙鏈DNA因固有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是一種惰性很強(qiáng)的化學(xué)分子。但由于是很長(zhǎng)的線性分子，而且缺乏橫向的穩(wěn)定性，因此很容易斷裂。盡管基因組DNA因來(lái)源、性質(zhì)以及用途不同，其分離純化的方法不盡相同，但有關(guān)分離純化的原則、主要步驟、主要試劑及其作用原理是一樣的。第二節(jié)基因組D