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《western blot試劑的準備》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、WesternBlot試劑的準備1.30%儲備膠溶液:丙烯酰胺(Acr)????????29.0g 亞甲雙丙烯酰胺(Bis)??????1.0g 混勻后ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室溫。2.4×分離膠緩沖液(1mol/LTris-HCl??PH8.8)??Tris??18.17g加ddH2O溶解,濃鹽酸調(diào)PH8.8,定容至100ml。3.4×濃縮膠緩沖液(0.5mol/LTris-HCl??PH6.8)??Tris??12.1g加ddH2O溶解,濃鹽酸調(diào)PH6.8,定容至100ml。4.10%SDS:電泳級SDS10.0g加ddH2O,68
2、℃助溶,濃鹽酸調(diào)PH7.2,定容至100ml。5.5×電泳緩沖液(PH8.3):????Tris????15.2g??????????????????????甘氨酸??94g????????????????????????ddH2O????定容到1000ml??????????????????????SDS????5g 先在974ml蒸餾水中加入Tris堿,待溶解完全后,再加甘氨酸,最后加SDS。6.10%過硫酸銨(AP):0.1g??AP加ddH2O至1.0ml,4℃保存,要在一周內(nèi)使用,最好新鮮配制。7.2×加樣緩沖液:2×SDS加樣緩沖液 0.5mol/LTris-HCl
3、(PH6.8)??2ml 10%SDS????????????4ml β-巰基乙醇??????????1ml 甘油??????????????2ml 1%溴芬藍????????????1ml 置4℃避光保存8.TEMED:注意室溫較低時TEMED量可加倍,最后灌膠之前再用9.轉(zhuǎn)膜緩沖液(TowbintransferBuffer):即1×SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4):????NaCl??????????8.5g (12H2O)Na2HPO4????2.9011g (2H2O)NH
4、2PO4??????0.24g 加ddH2O定容至????1000ml11.封閉液:??????????????????1×PBS中加入??????????30ml 5%(V/V)脫脂奶粉????????1.5g 0.02%疊氮鈉??????????0.006g 0.05%Tween-20??????????0.015g12.漂洗液(PBST):含0.05%Tween-20的PBS溶液 每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水飽和正丁醇:正丁醇??50ml ddH2O????5
5、ml????加入瓶中震蕩,使結(jié)合,存于室溫。 用時取上面一相加在凝膠上面。14.考馬斯亮藍染色法試劑:一般用G250考馬斯亮藍(蛋白定量專用)染色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250馬斯亮藍0.25g,用Whatman1號濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。(染色液多次回收利用) 脫色液:90ml甲醇:水(1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合液15.麗春紅S染色色法試劑:2%乙酸, 0.5%麗春紅的水溶液 脫色液:TBS16.Aprotinin:為一58氨基堿性多肽,經(jīng)反復(fù)凍融后,會發(fā)生集聚,儲存液應(yīng)分裝
6、成小份,保存于-20度,每一小份用后應(yīng)予廢棄。17.PMSF:在溶液中不穩(wěn)定,應(yīng)在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF,應(yīng)立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲液(1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中)保存于-20度。18.顯色液:聯(lián)苯胺顯色液(DAB) DAB????????????2ml 10%H2O2????????????60μl PBS(0.1mol/LPH6.4)??10ml19.三去污裂解緩沖液????????0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)??????
7、0.785g/100ml????????0.15mol/L??NaCl??????????????0.8775g/100ml????????0.02%疊氮鈉????????????????0.02g/100ml????????0.1%SDS??????????????????0.1g/100ml超級詳細配方:SDS-PAGE、蛋白轉(zhuǎn)印、WesternBlot試劑配制(***整理,2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.8)1.稱量181.7gT