western blot試劑的準(zhǔn)備

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1、WesternBlot試劑的準(zhǔn)備1.30%儲(chǔ)備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）????????29.0g　　　　　　　　　　　亞甲雙丙烯酰胺（Bis）??????1.0g　混勻后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室溫。2.4×分離膠緩沖液（1mol/LTris-HCl??PH8.8）??Tris??18.17g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)PH8.8，定容至100ml。3.4×濃縮膠緩沖液（0.5mol/LTris-HCl??PH6.8）??Tris??12.1g加ddH2O溶解，濃鹽酸調(diào)PH6.8，定容至100ml。4.10%SDS：電泳級(jí)SDS10.0g加ddH2O，68

2、℃助溶，濃鹽酸調(diào)PH7.2，定容至100ml。5.5×電泳緩沖液（PH8.3）：????Tris????15.2g??????????????????????甘氨酸??94g????????????????????????ddH2O????定容到1000ml??????????????????????SDS????5g　　先在974ml蒸餾水中加入Tris堿，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6.10%過(guò)硫酸銨（AP）：0.1g??AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周內(nèi)使用，最好新鮮配制。7.2×加樣緩沖液：2×SDS加樣緩沖液　　　0.5mol/LTris-HCl

3、(PH6.8)??2ml　　　10%SDS????????????4ml　　　β-巰基乙醇??????????1ml　　　甘油??????????????2ml　　　1%溴芬藍(lán)????????????1ml　　　置4℃避光保存8.TEMED：注意室溫較低時(shí)TEMED量可加倍，最后灌膠之前再用9.轉(zhuǎn)膜緩沖液(TowbintransferBuffer)：即1×SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4)：????NaCl??????????8.5g　　　　　　　　　　　　　　　(12H2O)Na2HPO4????2.9011g　　　　　　　　　　　　　　　(2H2O)NH

4、2PO4??????0.24g　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至????1000ml11.封閉液:??????????????????1×PBS中加入??????????30ml　　　　　　　　　　　5%（V/V）脫脂奶粉????????1.5g　　　　　　　0.02%疊氮鈉??????????0.006g　　　　　　　0.05%Tween-20??????????0.015g12.漂洗液（PBST）：含0.05%Tween-20的PBS溶液　　每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水飽和正丁醇：正丁醇??50ml　　　　　　　　　ddH2O????5

5、ml????加入瓶中震蕩，使結(jié)合，存于室溫?！　∮脮r(shí)取上面一相加在凝膠上面。14.考馬斯亮藍(lán)染色法試劑：一般用G250考馬斯亮藍(lán)（蛋白定量專用）染色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250馬斯亮藍(lán)0.25g，用Whatman1號(hào)濾紙過(guò)濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。（染色液多次回收利用）　　　　　　　　　脫色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液15.麗春紅S染色色法試劑：2%乙酸，　　　　　　　　　　　　　0.5%麗春紅的水溶液　　脫色液：TBS16.Aprotinin:為一58氨基堿性多肽，經(jīng)反復(fù)凍融后，會(huì)發(fā)生集聚，儲(chǔ)存液應(yīng)分裝

6、成小份，保存于-20度，每一小份用后應(yīng)予廢棄。17.PMSF：在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從儲(chǔ)存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲(chǔ)液（1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中）保存于-20度。18.顯色液：聯(lián)苯胺顯色液（DAB）　　　　　DAB????????????2ml　　　　　10%H2O2????????????60μl　　　　　PBS(0.1mol/LPH6.4)??10ml19.三去污裂解緩沖液????????0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)??????

7、0.785g/100ml????????0.15mol/L??NaCl??????????????0.8775g/100ml????????0.02%疊氮鈉????????????????0.02g/100ml????????0.1%SDS??????????????????0.1g/100ml超級(jí)詳細(xì)配方：SDS-PAGE、蛋白轉(zhuǎn)印、WesternBlot試劑配制(***整理，2004.9.6)1.5mol/LTris(PH8.8)1．稱量181.7gT