葉綠素的提取與分離

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1、葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的測定班級(jí)：11級(jí)生科2班組員：XXXXX實(shí)驗(yàn)名稱：葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的測定實(shí)驗(yàn)原理：葉綠體色素又稱光合色素，在高等植物中可分為葉綠素和類胡蘿卜素兩大類，前者包括葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色），后者包括胡蘿卜素（橙色）和葉黃素（黃色），它與們類囊體膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合形成色素蛋白復(fù)合體，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。層析的基本原理：在分離過程中，由一種流動(dòng)相（即一種液體或氣體）帶動(dòng)著試樣經(jīng)過固定相（一種支持物，如紙）向外擴(kuò)散，由于試樣在兩相中的溶解度不同和固定相對(duì)試樣中不同成分的吸附程度有別

2、，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各成分在兩相間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間層析后，可使試樣中的各種組分得到分離，在做紙層析時(shí)，由于紙對(duì)光合色素中各種色素分子的吸附程度不同，以及這些色素分子在溶劑四氯化碳（推進(jìn)劑）中溶解度也有差異，以致溶劑帶動(dòng)色素分子向四周移動(dòng)時(shí)，各種色素分子沿紙擴(kuò)散的速度也就不同，使混合色素分離，出現(xiàn)不同顏色的環(huán)。將提取的葉綠素溶液置于光下，在透射光呈綠色，在反射光下呈櫻桃紅色，種這現(xiàn)象稱為熒光現(xiàn)象。在反射光下葉綠素溶液之所以呈櫻桃紅色，是因?yàn)槿~綠色分子吸收光能后處于激狀發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它回到基態(tài)時(shí)，將所獲得的

3、能量以輻射能的形式發(fā)射出紅光量子。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光、高溫等的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H＋所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅后，其中的氫（H＋）又被銅（Cu2＋）取代，形成了銅代葉綠素，便由褐色轉(zhuǎn)變成藍(lán)綠色，銅代葉綠素很穩(wěn)定，且比原來的綠色還要穩(wěn)定些，在光下也不易被破壞。材料與設(shè)備試劑：1.材料新鮮的菠菜或小白菜等其他綠色植物葉片。2.設(shè)備電子天平、研缽、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、刻度試管、試管夾、試管架、酒精燈、剪刀、圓形濾紙、小漏斗等。3.試劑丙酮、四氯化碳、無水硫酸鈉、6mol/L鹽酸、醋酸銅

4、粉末、碳酸鈣等。方法與步驟：一、1.葉綠體色素的提取2.取菠菜或其他植物新鮮葉片5g，洗凈，擦干，去掉主脈后剪碎，放入研缽中。取材及實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作3.在研缽中加入少量碳酸鈣和約3-5mL丙酮后，研磨成勻漿，研磨過程中根據(jù)情況加入一定量的丙酮以利于研磨，勻漿用多層紗布過濾到試管中。4.在殘?jiān)性偌尤?~5mL丙酮，研磨過濾，共得深綠色溶液近10mL，其中含有葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素等色素及其它脂溶性物質(zhì)。二、1.葉綠體色素的分離2.紙層析分離法具體操作為：1.先用條濾紙（2cm×4cm）沿長度方向卷成一個(gè)緊實(shí)的紙芯。取一張圓形層析濾紙（直徑，略大于培養(yǎng)皿直徑），在其

5、中心位置鉆一個(gè)紙芯粗度的圓形小孔（濾紙不能折疊），將卷好的紙芯一端插入孔內(nèi)少許，并剪去紙芯上端多余部分，使紙芯上端與濾紙恰好平齊，下端長約1.5cm（與培養(yǎng)皿蓋高度同）。2.把個(gè)這帶紙芯的圓形濾紙，平放在干凈的培養(yǎng)皿上，用細(xì)玻璃滴管吸取少量葉綠體色素的丙酮提取液，小心地滴入紙芯上端7~10滴。注意：一定要在色素斑點(diǎn)稍風(fēng)干后，再滴入另一滴，而且液滴不能污染濾紙。3.向培養(yǎng)皿中倒入適量（約為培養(yǎng)皿高度的1/3左右）四氯化碳，并加入一勺（適量）的無水硫酸鈉，使紙芯下端浸入其中，并立即蓋上培養(yǎng)皿。此時(shí)，推動(dòng)劑借毛細(xì)管引力順紙芯擴(kuò)散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動(dòng)，數(shù)分鐘后，就可

6、見到濾紙上出現(xiàn)四或五個(gè)顏色不同的同心環(huán)，并逐漸擴(kuò)大。4.當(dāng)推動(dòng)劑前沿接近濾紙邊緣時(shí)（約30min左右），取出濾紙，即可看到分離的各種色素，用筆鉛標(biāo)出各種色素的位置和名稱，并繪簡圖示之或拍攝圖片。三、葉綠體色素的理化性質(zhì)1．熒光現(xiàn)象觀察葉片丙酮提取液（稀釋前的濃提取液）在反射光和透射光下的顏色有何不同并拍攝圖片。葉綠體色素溶液在反射光下呈櫻桃紅色，在透射光下呈綠色，說明原因。光對(duì)葉綠素的破壞作用取葉綠體色素提取液少許，分裝于2支試管中，一支放在黑暗處或用黑紙遮光）；另一支放在強(qiáng)光下（陽光直射），經(jīng)0.5~1h后，觀察2支試管中溶液顏色有何不同并拍攝圖片。2.氫和銅對(duì)葉綠素中鎂的

7、取代作用取2個(gè)試管，A管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液2mL，作為對(duì)照；在B管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液5mL并加入1~2滴濃鹽酸，勻搖，溶液變?yōu)楹稚臄z圖片，此時(shí)葉綠素中的鎂（Mg2＋）被氫（H＋）取代而生成了去鎂葉綠素。從B管中分出一半裝人C管，作為對(duì)照，在B管余下的溶液中加入一小粒醋酸銅結(jié)晶，將B管和C管都在酒精燈上慢慢加熱，則B管中的溶液又轉(zhuǎn)變?cè)谒{(lán)綠色，拍攝圖片，這是因?yàn)槠渲械臍洌℉＋）又被銅（Cu2＋）取代，形成了銅代葉綠素?！咀⒁馐马?xiàng)】（1）研磨葉片要充分，否則提取的葉綠體色素溶液濃度