葉綠素的提取與分離

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1、葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的測定班級：11級生科2班組員：XXXXX實驗名稱：葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的測定實驗原理：葉綠體色素又稱光合色素，在高等植物中可分為葉綠素和類胡蘿卜素兩大類，前者包括葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色），后者包括胡蘿卜素（橙色）和葉黃素（黃色），它與們類囊體膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合形成色素蛋白復(fù)合體，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。層析的基本原理：在分離過程中，由一種流動相（即一種液體或氣體）帶動著試樣經(jīng)過固定相（一種支持物，如紙）向外擴(kuò)散，由于試樣在兩相中的溶解度不同和固定相對試樣中不同成分的吸附程度有別

2、，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，可使試樣中的各種組分得到分離，在做紙層析時，由于紙對光合色素中各種色素分子的吸附程度不同，以及這些色素分子在溶劑四氯化碳（推進(jìn)劑）中溶解度也有差異，以致溶劑帶動色素分子向四周移動時，各種色素分子沿紙擴(kuò)散的速度也就不同，使混合色素分離，出現(xiàn)不同顏色的環(huán)。將提取的葉綠素溶液置于光下，在透射光呈綠色，在反射光下呈櫻桃紅色，種這現(xiàn)象稱為熒光現(xiàn)象。在反射光下葉綠素溶液之所以呈櫻桃紅色，是因為葉綠色分子吸收光能后處于激狀發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它回到基態(tài)時，將所獲得的

3、能量以輻射能的形式發(fā)射出紅光量子。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光、高溫等的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H＋所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅后，其中的氫（H＋）又被銅（Cu2＋）取代，形成了銅代葉綠素，便由褐色轉(zhuǎn)變成藍(lán)綠色，銅代葉綠素很穩(wěn)定，且比原來的綠色還要穩(wěn)定些，在光下也不易被破壞。材料與設(shè)備試劑：1.材料新鮮的菠菜或小白菜等其他綠色植物葉片。2.設(shè)備電子天平、研缽、燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、刻度試管、試管夾、試管架、酒精燈、剪刀、圓形濾紙、小漏斗等。3.試劑丙酮、四氯化碳、無水硫酸鈉、6mol/L鹽酸、醋酸銅

4、粉末、碳酸鈣等。方法與步驟：一、1.葉綠體色素的提取2.取菠菜或其他植物新鮮葉片5g，洗凈，擦干，去掉主脈后剪碎，放入研缽中。取材及實驗前準(zhǔn)備工作3.在研缽中加入少量碳酸鈣和約3-5mL丙酮后，研磨成勻漿，研磨過程中根據(jù)情況加入一定量的丙酮以利于研磨，勻漿用多層紗布過濾到試管中。4.在殘渣中再加入3~5mL丙酮，研磨過濾，共得深綠色溶液近10mL，其中含有葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素等色素及其它脂溶性物質(zhì)。二、1.葉綠體色素的分離2.紙層析分離法具體操作為：1.先用條濾紙（2cm×4cm）沿長度方向卷成一個緊實的紙芯。取一張圓形層析濾紙（直徑，略大于培養(yǎng)皿直徑），在其

5、中心位置鉆一個紙芯粗度的圓形小孔（濾紙不能折疊），將卷好的紙芯一端插入孔內(nèi)少許，并剪去紙芯上端多余部分，使紙芯上端與濾紙恰好平齊，下端長約1.5cm（與培養(yǎng)皿蓋高度同）。2.把個這帶紙芯的圓形濾紙，平放在干凈的培養(yǎng)皿上，用細(xì)玻璃滴管吸取少量葉綠體色素的丙酮提取液，小心地滴入紙芯上端7~10滴。注意：一定要在色素斑點(diǎn)稍風(fēng)干后，再滴入另一滴，而且液滴不能污染濾紙。3.向培養(yǎng)皿中倒入適量（約為培養(yǎng)皿高度的1/3左右）四氯化碳，并加入一勺（適量）的無水硫酸鈉，使紙芯下端浸入其中，并立即蓋上培養(yǎng)皿。此時，推動劑借毛細(xì)管引力順紙芯擴(kuò)散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，數(shù)分鐘后，就可

6、見到濾紙上出現(xiàn)四或五個顏色不同的同心環(huán)，并逐漸擴(kuò)大。4.當(dāng)推動劑前沿接近濾紙邊緣時（約30min左右），取出濾紙，即可看到分離的各種色素，用筆鉛標(biāo)出各種色素的位置和名稱，并繪簡圖示之或拍攝圖片。三、葉綠體色素的理化性質(zhì)1．熒光現(xiàn)象觀察葉片丙酮提取液（稀釋前的濃提取液）在反射光和透射光下的顏色有何不同并拍攝圖片。葉綠體色素溶液在反射光下呈櫻桃紅色，在透射光下呈綠色，說明原因。光對葉綠素的破壞作用取葉綠體色素提取液少許，分裝于2支試管中，一支放在黑暗處或用黑紙遮光）；另一支放在強(qiáng)光下（陽光直射），經(jīng)0.5~1h后，觀察2支試管中溶液顏色有何不同并拍攝圖片。2.氫和銅對葉綠素中鎂的

7、取代作用取2個試管，A管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液2mL，作為對照；在B管中加入稀釋后的葉綠體色素提取液5mL并加入1~2滴濃鹽酸，勻搖，溶液變?yōu)楹稚臄z圖片，此時葉綠素中的鎂（Mg2＋）被氫（H＋）取代而生成了去鎂葉綠素。從B管中分出一半裝人C管，作為對照，在B管余下的溶液中加入一小粒醋酸銅結(jié)晶，將B管和C管都在酒精燈上慢慢加熱，則B管中的溶液又轉(zhuǎn)變在藍(lán)綠色，拍攝圖片，這是因為其中的氫（H＋）又被銅（Cu2＋）取代，形成了銅代葉綠素。【注意事項】（1）研磨葉片要充分，否則提取的葉綠體色素溶液濃度