資源描述:
《幾種酵母轉(zhuǎn)化方法》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、幾種酵母轉(zhuǎn)化方法酵母轉(zhuǎn)化原理:像釀酒酵母,線性化的轉(zhuǎn)化DNA和Pichiapastoris基因組的同源區(qū)域發(fā)生同源重組,使得線性化DNA產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子(Creggetal.,1985;Creggetal.,1989).這樣的整合方式顯示極強(qiáng)的穩(wěn)定性,即使多拷貝轉(zhuǎn)化子在沒有選擇壓力的情況下也很穩(wěn)定.單交換事件(插入)比雙交換事件(置換)發(fā)生幾率更大.單插入事件中約發(fā)生1-10%概率的多插入事件.電轉(zhuǎn)化注意點(diǎn):一、制備感受態(tài)的菌液收集時(shí)間:1、準(zhǔn)確測(cè)定OD值:OD在1.2~1.5之間。1)為了準(zhǔn)確測(cè)定OD值,建議將菌液稀釋不同濃度測(cè)定(1、2、4、8、16倍稀釋,看其OD值是否呈線性關(guān)系)。每個(gè)
2、倍數(shù)做3-5個(gè)重復(fù),應(yīng)該可以大致推斷OD值是否準(zhǔn)確!菌液看上去渾濁,但OD值不高,很可能OD稀釋倍數(shù)不夠!2)OD值是否測(cè)準(zhǔn)也可以這樣估算:OD600為40左右時(shí),菌體濕重(6000rpm離心5min)約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重將相應(yīng)下降。2、75ml的菌,經(jīng)18h左右的培養(yǎng),最后sorbital洗滌完畢后,50ml離心管里所剩菌體特別濃,需要1mlsorbitol才可溶解為糊狀。正常培養(yǎng)的OD在1.2~1.5之間的500ml菌液,收集的感受態(tài)也用1ml稀釋的,沒那么粘稠。可以看看降低培養(yǎng)溫度(27攝氏度)或縮短培養(yǎng)時(shí)間(12h)。3、甚至不用轉(zhuǎn)接,直接挑單克隆在50-100
3、mlYPD中搖過夜,效果也很好二、制備感受態(tài)的菌液量如果只轉(zhuǎn)一個(gè)樣品,50ml就夠了,一般50ml的培養(yǎng)液如果OD值正常的話夠做10管感受態(tài)的,其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液,然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態(tài),每一步的離心時(shí)間30秒就行。整個(gè)流程時(shí)間短,制備好的感受態(tài)用來做轉(zhuǎn)化的效率很高。山梨醇離心,洗滌的過程之后的重懸的時(shí)候注意濃度,不要過于粘稠和稀釋。三、感受態(tài)的保存感受態(tài)細(xì)胞做好后由于電轉(zhuǎn)化杯還沒有處理好等原因,在冰上放幾個(gè)小時(shí)再做可能有一定的影響,盡量馬上制備馬上轉(zhuǎn)化。如果感受態(tài)細(xì)胞要保存,不需要加甘油,一般80ulEP管分裝,-70或-80攝氏度保存。另附:酵母G
4、S115點(diǎn)種分離純化接種GS115于5mlYPD液體培養(yǎng)基,30℃,200rpm振蕩過夜,涂布YPD平板,30℃培養(yǎng)48小時(shí),用YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化,挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板,4℃保存。四、電轉(zhuǎn)化注意點(diǎn):1、感受態(tài)做好后,最后一次吸出sorbital時(shí),不是直接倒調(diào)的,而是用毛細(xì)管輕吸出來的,這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。2、最后用毛細(xì)管取出100ul出來,加入質(zhì)粒,混勻?。ㄅ铝坎粔颍煤芏?,電轉(zhuǎn)時(shí)效果反而不好。)3、電轉(zhuǎn)杯清潔處理:一般先沖洗,洗凈;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我們都是放在超凈臺(tái)上,開啟紫外,邊吹
5、風(fēng)晾干,邊進(jìn)行紫外照射。電轉(zhuǎn)杯的新包裝或重復(fù)使用可能對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定的影響。4、電擊的時(shí)候,電壓數(shù)以及電擊時(shí)間可以摸索一下,適當(dāng)增加電壓或者延長(zhǎng)電擊時(shí)間都可以。電擊條件比如1.5kv,放電4.8~5.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進(jìn)行,電擊時(shí)間可以減少一點(diǎn),設(shè)置為5ms左右,電擊之后馬上加入預(yù)冷的山梨醇溶液,轉(zhuǎn)移至EP管,30度靜止培養(yǎng)1h。如果菌體懸液濃度比較大的時(shí)候,在制備感受態(tài)的時(shí)候要留心一下操作中的問題了。5、電擊之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5ml的ep管中,置于30度搖床低速培養(yǎng)1h,再涂板。6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT單獨(dú)于-20
6、度保存,可配成100倍的貯備液。7、轉(zhuǎn)化后1ml用sorbitol重懸的細(xì)胞懸液不能全部涂在一塊板子上,按標(biāo)準(zhǔn)程序制作的感受態(tài)一般3塊左右可能比較合適,以干燥后看見一薄層淡淡的白色為宜。轉(zhuǎn)化子會(huì)在白色的薄層上長(zhǎng)出圓韻、飽滿的大菌落的。五、轉(zhuǎn)化試劑和培養(yǎng)基的正確準(zhǔn)備方法1、MD板子提前幾天做好,放在冰箱里,涂板的時(shí)候吸收效果會(huì)好些。如果是新板子,可能吸收不是太好,板子上有些積層,反而不利于生長(zhǎng)。2、YNB42度水浴一會(huì),然后過濾除菌,YNB是加到培養(yǎng)基里面的,去離子水pH偏低,建議直接用蒸餾水就可以(關(guān)系不是太大)。3、山梨醇,以及無菌去離子水均是冰凍,存放在4度冰箱中4、一般用10ug以上質(zhì)粒
7、用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,約20ulddH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于100個(gè)克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細(xì)胞,轉(zhuǎn)化效率很高,可以試試。建議你不要用膠回收kit,回收的DNA可能還有鹽,導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。5個(gè)電轉(zhuǎn)化方案方法一:高效1.收集菌體取1mlGS115過夜培養(yǎng)物(OD約6-10)分裝到1.5mlEP管中,4℃、10000g離心1min,棄上清