小干擾rna的合理設(shè)計

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1、小干擾RNA的合理設(shè)計【關(guān)鍵詞】RNAisiRNAshRNA設(shè)計基因沉默0引言大量實驗表明，針對同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，為了能夠運(yùn)用RNAi技術(shù)更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)―siRNA序列的設(shè)計方面進(jìn)行更多的改進(jìn)。本文將在以下幾個方面探討siRNA序列設(shè)計方面的最新研究進(jìn)展，作為應(yīng)用RNAi技術(shù)時的參考。1SiRNA序列的設(shè)計RNAi最終要通過siRNA片段與靶基因結(jié)合并使之降解，因此，確保高度同源于靶基因而絕無與其他基因同源的siRNA序列，是決定RNAi特異性的關(guān)鍵

2、所在，也是siRNA設(shè)計的基本原則。從具有不同沉默效率的siRNA序列中篩選出高效的siRNA序列，需要經(jīng)過嚴(yán)密的設(shè)計和不斷的實驗檢驗[1]。1.1siRNA序列在靶基因中的位置12從靶基因起始密碼子AUG下游50～100個核苷酸開始搜尋理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。以前的研究表明：不要以5′非翻譯區(qū)（5′UTR）和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）及起始密碼子附近序列作為設(shè)計siRNA的模板，這些區(qū)域含有調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(如翻譯起始復(fù)合物)，調(diào)節(jié)蛋白可與RISC競爭結(jié)合siRNA序列，降低RNAi

3、效應(yīng)[3]；也要避開外顯子與外顯子的交界區(qū)域和單核苷酸多形性(SNP)區(qū)域。最近，Yokota等發(fā)現(xiàn)在HCV(丙型肝炎病毒)基因組中，5′UTR是一個高度保守區(qū)，使之成為siRNA理想的靶點(diǎn)。運(yùn)用RNAi技術(shù)作用于5′UTR或3′UTR序列，同樣可引起靶基因沉默[4,5]，這些發(fā)現(xiàn)使基因功能分析領(lǐng)域擴(kuò)展到5′UTR和3′UTR內(nèi)。1.2siRNA序列的起始堿基與長度SiRNA序列最好為AA(Nn)UU(N代表任意堿基；n為堿基數(shù)目，在19～29nt之間)，NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也可以。以前的研究表明，典型siRNA的三

4、大結(jié)構(gòu)特征是：長度為21～23nt；siRNA雙鏈的3′端各有兩個突出堿基；siRNA雙鏈的5′端有磷酸基團(tuán)。以AAN19標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計的siRNA，在哺乳動物細(xì)胞中70%～80%可產(chǎn)生RNAi作用。但是一些具有較小脫靶效應(yīng)的siRNA序列不是以AA為起始的，所以現(xiàn)在不推薦以“AA為起始”作為選擇標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。最新研究表明[7,8]，27nt或29nt的siRNA與21nt12siRNA相比：（1）其抑制活性可提高數(shù)倍以上；（2）不易于誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)和激活PKR；（3）一些基因?qū)?1ntsiRNA不敏感，但是可以被27ntsiRNA有效

5、的抑制；（4）與21ntSiRNA相比，27ntSiRNA對靶基因的最大抑制率可在相對低的濃度下得到。另外，在選擇siRNA序列時，要考慮到所用啟動子的類型。U6啟動子要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第一個堿基是G，正反義鏈均如此；H1啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第一位堿基為U、G、C均不影響基因的沉默效果[9]。1.3siRNA3′端突出堿基的選擇當(dāng)siRNA的3′端突出堿基為UU時，其基因抑制效率最高；但是3′端的突出堿基不能為G，因為RNase會降解以G為末尾的RNA單鏈。Elbashir等［2］建議用dTdT取代3′端的2個堿基突出，增強(qiáng)siRNA雙鏈復(fù)合

6、體的穩(wěn)定性。需要注意的是，由于雙鏈siRNA中的正義鏈不參與對靶mRNA的識別，所以正義鏈的3′端突出堿基可以用dTdT替代，但是反義鏈3′端突出堿基必需與靶mRNA序列相同的。1.4siRNA序列中G/C含量的選擇在siRNA序列中，G/C含量的選擇比確定以AA為起始的序列更重要。具有均衡堿基含量(即G/C含量在30%～70%)的序列可以作為siRNA候選序列；而具有較低G/C含量（30%～52%）的siRNA序列，其沉默基因效果較好[10]。121.5siRNA中應(yīng)避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列[10,11]因為連續(xù)2個以上的G

7、和C可以降低雙鏈RNA的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制RNAi作用[12]；連續(xù)3個以上的U和A可能終止由RNAPolymeraseIII介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[13]。siRNA序列中的重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在可以降低siRNA的有效濃度和沉默效率。1.6siRNA雙鏈的內(nèi)在穩(wěn)定性siRNA反義鏈5’端具有較低的熱穩(wěn)定性，即反義鏈5’端的第一個堿基為A或U；siRNA正義鏈的5’端第一個堿基為G或C。因為siRNA解旋可能從富含A/U的反義鏈5’端有效的起始，有利于反義鏈與RISC的結(jié)合，而抑制正義鏈與RISC的結(jié)合[14]。

8、1.7siRNA正義鏈的堿基偏愛性以3’端具有2個堿基突出的19ntsiRNA為例，正義鏈的第一位和第十九位堿基為A；正義鏈的第十位堿基為U；正義鏈的第十三位堿基不為G；正義鏈的第十九位堿基不為G或C時，siRNA序列具