western_blot配方與方法

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1、WesternBlot覺(jué)得割膠用電話卡很容易割破,然后剪膜目測(cè)真的好難,膜的蛋白面不好判斷不知道有沒(méi)有好的方法?配膠:先配分離膠,再配濃縮膠。(物品大部分在新冰箱4度,用完最好盡快擰緊放回)我們實(shí)驗(yàn)室常配的(單位均為ml)分離膠10ml分離膠15ml濃縮膠2ml濃縮膠4ml超純水2.03.01.42.730%Acr/Bic(丙烯酰胺)4.06.00.330.671.5mol/LTris·HCl(pH8.8)3.85.71mol/LTris·HCl(pH6.8)0.250.510%SDS0.10.150.020.0410%APS(過(guò)硫胺酸)0.10.150.020.04TEMED0.0

2、040.0060.0020.004注意:TEMED量很少,所以要注意觀察有沒(méi)有吸上來(lái),也要注意不能插太深,防止槍頭壁上粘太多步驟:.樣品制備1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2.棄培養(yǎng)基,用1XPBS漂洗細(xì)胞2次,去盡殘留培養(yǎng)基。3.加入1XSDS樣品緩沖液(6-wellplate(6孔板),100μl/w或75cm2plate,500-1000μl/瓶),刮落細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到Ep管。注意:冰上操作。4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。5.煮沸樣品5minutes。6.離心12000g,5min,取上清。(可?。?.電泳分離:上樣15μl~20μl至SDS-PAGE膠(10cmx10cm

3、)電泳。如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平,應(yīng)用RIPA裂解液(1mlper107cells/100mmdish(培養(yǎng)皿)/150cm2flask)裂解細(xì)胞,收集裂解液至離心管中,在振蕩器上混勻4~15min,14000g離心15min(4℃),棄沉淀,用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量,進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照,通常用beta-actin。注意:一般上樣20~30μg已足夠,如待檢蛋白為低豐度蛋白,可加大上樣量至100μg,但電泳條帶易拖尾,可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。(1)清洗玻璃板:一只手扣緊玻璃板,用洗潔精

4、將板洗凈。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。(2)配膠與上樣:先配分離膠,再配濃縮膠。1、玻璃板對(duì)齊后放入制膠架中卡緊(一定要對(duì)齊,以免漏膠)。然后垂直卡在夾子上準(zhǔn)備配膠。2、按前面方法配分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),用槍吸取1ml膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶下緣以下5mm高度時(shí)即可,給積層膠留出足夠空間(梳齒長(zhǎng)再加1cm)。然后膠上加一層無(wú)水酒精,液封后的膠凝的更快。(灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些,膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要慢,否則膠會(huì)被沖變型。)3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),說(shuō)

5、明膠已凝固(30min)。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上的酒精,并用濾紙將酒精吸干。4、按前面的方法配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平(梳子使用前保證干凈且干燥)。待到濃縮膠凝固后(室溫30min),將凝膠放入電泳槽中,小玻璃板面朝內(nèi)(若只跑一塊膠,則槽的另一邊要墊一塊塑料板,且有字的一面朝內(nèi))。在上下槽內(nèi)加入電泳液,上槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒(méi)過(guò)小玻璃板上緣,下槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒(méi)過(guò)金屬絲,排除凝膠底部?jī)蓧K玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎

6、直向上輕輕將其拔出。5、用電泳液沖洗一下濃縮膠,(目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺,以免造成條帶變形)可以前一天配膠備用,保鮮膜4度保存,可一周。6、制備樣品:測(cè)完蛋白濃度后,計(jì)算含20—50μg蛋白(根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇,沒(méi)有固定的量,一般為40—50ug。)的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200μl的EP管中,加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×(上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4)。(上樣體積一般在10μl與20μl之間)(其實(shí)大一點(diǎn)的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)到40μl,膠做得很好的話,50μl問(wèn)題也不大)上樣前要將樣品100℃加熱5-15min使蛋白

7、變性,立即冰浴,然后低速離心5min。(可以使用PCR儀進(jìn)行變性(95℃,10min))應(yīng)根據(jù)上樣緩沖液濃度的不同,制備樣品。樣品分裝成小管,儲(chǔ)于-80℃。蛋白質(zhì)在非變性條件下的電泳分離是由其分子量大小與電荷共同決定的,在變性條件下與SDS結(jié)合后,其電泳分離只由分子量大小決定。7、加足夠的電泳液后準(zhǔn)備上樣。上樣之前一定要把上樣孔沖洗干凈,沖走未凝固的丙烯酰胺。用移液槍將樣品吸出,注意不要吸進(jìn)氣泡。將槍頭插至上樣孔中加入樣品(上樣速度要快,防止樣品擴(kuò)散導(dǎo)致相

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