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1、WesternBlot配液：1.10%SDS溶液(m/v)：SDS0.1gDDH2O1ml加熱溶解，室溫保存，用后馬上擰緊瓶蓋。2.10%過硫酸銨:APS0.1gDDH2O1ml由于過硫胺酸會緩慢分解，最好新鮮配制，或隔周配制（也可每200微升EP分裝，4℃保存4W，-20℃保存1月）3.1×電泳緩沖液Trisbase3.028gGlycine14.4gSDS1.0g用蒸餾水溶解至1000ml，調(diào)整PH8.3。冰箱內(nèi)可保存數(shù)月。4.10×轉(zhuǎn)膜液（儲存液）甘氨酸72.07gTrisbase15.14gDDH2O400ml加水至500ml，儲存液不加甲醇，4℃保存。1
2、×轉(zhuǎn)膜液1L配制：10×轉(zhuǎn)膜液儲存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O750ml，PH8.5，定容至總量1L5.1×轉(zhuǎn)膜液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：Trisbase3.03gGlycine14.42g甲醇150ml加水定容至1000ml6.10×TBS：Trisbase12.1gNaCl40g加水，用濃鹽酸調(diào)整PH至7.6后定容至500ml7.TBST：1×TBS/吐溫=1000/18.封閉液：脫脂奶粉2gTBST40ml配膠：先配分離膠，再配積層膠。一般兩者同時配制，只是最后分離膠先加TEMED混合后立即灌膠，而積層膠放4℃，等分離膠凝固后再加TEMED混勻后灌膠。（
3、為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實驗當(dāng)時的溫度適當(dāng)調(diào)整）2ml5%積層膠3ml5%積層膠5ml8%分離膠5ml10%分離膠10%兩塊膠5ml15%分離膠超純水1.42.12.31.92.851.130％Acr/Bic0.330.4951.31.72.552.51.5mol/LTris·HCl（pH8.8）1.31.30.951.31mol/LTris·HCl（pH6.8）0.250.37510％SDS0.020.030.050.050.0750.0510%APS（過硫胺酸）0.020.030.050.050.0750.0
4、5TEMED0.0020.0030.0030.0020.0030.002雙丙烯酰胺：丙烯酰胺摩爾比1：29配制時，SDS-PAGE有效分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。步驟：（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，用洗潔精將板洗凈。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2）配膠與上樣：先配分離膠
5、，再配積層膠。1、玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊（一定要對齊，以免漏膠）。然后垂直卡在夾子上準(zhǔn)備配膠。2、按前面方法配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，用槍吸取1ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶下緣以下5mm高度時即可，給積層膠留出足夠空間（梳齒長再加1cm）。然后膠上加一層去離子水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固（30min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上的水，再用
6、去離子水洗滌數(shù)次，并用濾紙將水吸干。4、按前面的方法配5％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平（梳子使用前保證干凈且干燥）。待到濃縮膠凝固后（室溫30min），將凝膠放入電泳槽中，小玻璃板面朝內(nèi)（若只跑一塊膠，則槽的另一邊要墊一塊塑料板，且有字的一面朝內(nèi)）。在上下槽內(nèi)加入電泳液，上槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過小玻璃板上緣，下槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過金屬絲，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、用電泳液沖
7、洗一下濃縮膠，（目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成條帶變形）可以前一天配膠備用，保鮮膜4度保存，可一周。6、制備樣品：測完蛋白濃度后，計算含20—50μg蛋白（根據(jù)自己的實驗需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量，一般為40—50ug。）的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200μl的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×（上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4）。（上樣體積一般在10μl與20μl之間）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)到40μl，膠做得很好的話，50μl問題也不大）上樣前要將樣品100℃加熱5-15min使蛋白變性，立即冰浴
8、，然后低速
