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《western_blot配方與方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、WesternBlot覺得割膠用電話卡很容易割破，然后剪膜目測真的好難，膜的蛋白面不好判斷不知道有沒有好的方法？配膠：先配分離膠，再配濃縮膠。（物品大部分在新冰箱4度，用完最好盡快擰緊放回）我們實驗室常配的（單位均為ml）分離膠10ml分離膠15ml濃縮膠2ml濃縮膠4ml超純水2．03．01．42．730％Acr/Bic（丙烯酰胺）4．06．00．330．671.5mol/LTris·HCl（pH8.8）3．85．71mol/LTris·HCl（pH6.8）0．250．510％SDS0．10．150．020．0410%APS（過硫胺酸）0．10．150．020．04TEMED0．0
2、040．0060．0020．004注意：TEMED量很少，所以要注意觀察有沒有吸上來，也要注意不能插太深，防止槍頭壁上粘太多步驟：.樣品制備1．培養(yǎng)細胞或藥物處理。2．棄培養(yǎng)基，用1XPBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3．加入1XSDS樣品緩沖液(6-wellplate(6孔板),100μl/w或75cm2plate,500-1000μl/瓶)，刮落細胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4．超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。5．煮沸樣品5minutes。6．離心12000g,5min，取上清。（可?。?．電泳分離：上樣15μl~20μl至SDS-PAGE膠(10cmx10cm
3、)電泳。如要定量檢測某蛋白的表達水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1mlper107cells/100mmdish（培養(yǎng)皿）/150cm2flask)裂解細胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min（4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。注意：一般上樣20~30μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，用洗潔精
4、將板洗凈。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2）配膠與上樣：先配分離膠，再配濃縮膠。1、玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊（一定要對齊，以免漏膠）。然后垂直卡在夾子上準(zhǔn)備配膠。2、按前面方法配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，用槍吸取1ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶下緣以下5mm高度時即可，給積層膠留出足夠空間（梳齒長再加1cm）。然后膠上加一層無水酒精，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說
5、明膠已凝固（30min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上的酒精，并用濾紙將酒精吸干。4、按前面的方法配5％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平（梳子使用前保證干凈且干燥）。待到濃縮膠凝固后（室溫30min），將凝膠放入電泳槽中，小玻璃板面朝內(nèi)（若只跑一塊膠，則槽的另一邊要墊一塊塑料板，且有字的一面朝內(nèi)）。在上下槽內(nèi)加入電泳液，上槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過小玻璃板上緣，下槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過金屬絲，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎
6、直向上輕輕將其拔出。5、用電泳液沖洗一下濃縮膠，（目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成條帶變形）可以前一天配膠備用，保鮮膜4度保存，可一周。6、制備樣品：測完蛋白濃度后，計算含20—50μg蛋白（根據(jù)自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量，一般為40—50ug。）的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200μl的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×（上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4）。（上樣體積一般在10μl與20μl之間）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達到40μl，膠做得很好的話，50μl問題也不大）上樣前要將樣品100℃加熱5-15min使蛋白
7、變性，立即冰浴，然后低速離心5min。（可以使用PCR儀進行變性（95℃,10min））應(yīng)根據(jù)上樣緩沖液濃度的不同，制備樣品。樣品分裝成小管，儲于-80℃。蛋白質(zhì)在非變性條件下的電泳分離是由其分子量大小與電荷共同決定的，在變性條件下與SDS結(jié)合后，其電泳分離只由分子量大小決定。7、加足夠的電泳液后準(zhǔn)備上樣。上樣之前一定要把上樣孔沖洗干凈，沖走未凝固的丙烯酰胺。用移液槍將樣品吸出，注意不要吸進氣泡。將槍頭插至上樣孔中加入樣品（上樣速度要快，防止樣品擴散導(dǎo)致相
