5雜氮2脫氧胞苷對BGC823胃癌細胞株RIZ1基因去甲基化轉錄調控作用.doc

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1、5雜氮2脫氧胞苷對BGC823胃癌細胞株RIZ1基因去甲基化轉錄調控作用【摘要】目的:探討5雜氮2脫氧胞苷（5AzaCdR）對人胃癌細胞系BGC823細胞株RIZ1基因的去甲基化轉錄調控作用及對細胞株生長增殖的影響，尋找胃癌治療的新靶點.方法:使用3種不同濃度5AzaCdR干預胃癌BGC823細胞，甲基化特異性PCR（MSP）和逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測藥物干預前后RIZ1基因的甲基化狀態(tài)和RIZ1mRNA的表達；MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞術分析細胞周期及細胞凋亡的改變.結果:

2、未經5AzaCdR處理的BGC823細胞中RIZ1基因啟動子區(qū)域CpG島高甲基化，且RIZ1mRNA不表達，經2，5，10μmol/L5AzaCdR處理48h后，RIZ1基因啟動子區(qū)域高甲基化得到逆轉，細胞中均有RIZ1mRNA表達，相對定量值分別為0.509，0.716，0.831；3種濃度5AzaCdR處理BGC823細胞后，與對照組比較，細胞增殖速度出現不同程度減慢（P＜0.05），隨著濃度的增加其抑制作用增強；并顯著抑制BGC823細胞生長周期,與對照組相比，G0/G1期細胞數增加，S期細胞

3、數減少，細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）.結論:5AzaCdR能有效逆轉胃癌BGC823細胞RIZ1基因的異常甲基化，從而激活因高甲基化導致RIZ1基因沉默的再轉錄，誘導該基因的表達，抑制腫瘤細胞生長.【關鍵詞】胃腫瘤腫瘤細胞，培養(yǎng)的5雜氮2′脫氧胞苷RIZ1基因DNA甲基化　　0引言　　抑癌基因失活是胃癌發(fā)生的重要原因，多種抑癌基因由于啟動子區(qū)域CpG島高甲基化而導致其失活已得到廣泛證實.DNA甲基轉移酶抑制劑5雜氮2脫氧胞苷（5AzaCdR）通過抑制甲基化酶，可使多種啟動子區(qū)域高甲基

4、化的抑癌基因重新表達或表達增高［1］.RIZ基因（Rbinteractingzincfingergene）是Buyse等［2］對可與Rb結合的蛋白質進行功能性篩選時分離出的，定位于人染色體1p36.能夠產生兩種交替出現的蛋白產物RIZ1和RIZ2.RIZ1基因是一種新型腫瘤抑制基因，在胃癌中對該基因的研究，國內少見報道.為研究胃癌中該基因的甲基化狀態(tài)及CpG島去甲基化后其轉錄活性的表達，我們應用5AzaCdR對BGC823細胞進行處理，觀察RIZ1基因轉錄表達情況及細胞生物學特性的改變，從而為胃癌的臨床治療

5、提供分子水平依據.　　1材料和方法　　1.1材料人胃癌細胞株BGC823由蘭州大學基礎醫(yī)學院病理學分子生物學實驗室饋贈；RPMI1640（Gibco公司）；5AzaCdR（Sigma公司），用PBS充分溶解后配制成1mol/L的母液，-20℃保存.EZDNAMethylationGoldKit(北京天漠科技開發(fā)有限公司),5AMV第1鏈cDNA試劑盒及PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；引物合成（大連寶生物工程有限公司），MTT及PI（Sigma公

6、司）.　　1.2方法　　1.2.1細胞培養(yǎng)和干預將BGC823細胞用含100mL/L小牛血清、100ku/L青霉素和100ku/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在50mL/LCO2濃度，37℃、濕度飽和的條件下培養(yǎng).另配制含2,5,10μmol/L5AzaCdR的完全培養(yǎng)液.取傳代后24h的細胞，分別加入含3種不同5AzaCdR濃度的完全培養(yǎng)液，根據實驗要求，培養(yǎng)48,72h后回收細胞.對照組使用不含5AzaCdR的普通完全培養(yǎng)液.　　1.2.2MSP法檢測5AzaCdR干預前后BGC823

7、細胞中RIZ1基因甲基化狀態(tài)取對照組和藥物干預48h后BGC823細胞，應用飽和酚氯仿法抽提細胞基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度及含量.取20μgDNA，參照EZDNAMethylationGoldKit說明書對基因組DNA行亞硫酸氫鹽修飾.以亞硫酸氫鹽修飾后DNA為模板，使用甲基化擴增試劑盒分別用甲基化引物和非甲基化引物進行PCR擴增，所有PCR擴增均使用25μL反應體系.引物參考文獻［3］，甲基化引物：上游5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′，下游：5′GCTATTTCG

8、CCGACCCCGACG3′，擴增片段為177bp，PCR反應條件：95℃變性10min，94℃變性30s，68℃退火45s，72℃延伸60s，共40個循環(huán)后，72℃延伸6min；非甲基化引物：上游5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′，下游5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′，擴增片段為175bp,PCR反應條件：95℃變性10min，94℃變性3