Bacillus cereus中羰基還原酶的基因挖掘及克隆表達(dá)研究

《Bacillus cereus中羰基還原酶的基因挖掘及克隆表達(dá)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、分類號(hào)０８１２學(xué)號(hào)２０１５２２７０３０３２學(xué)校代碼１０４８８密級(jí)公開碩士學(xué)位論文Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ中羰基還原酶的基因挖掘及克隆表達(dá)研究學(xué)位申請(qǐng)人：阮濤學(xué)科專業(yè)：化學(xué)工程與技術(shù)指導(dǎo)教師：楊忠華教授答辯日期：２０１８年５月２０日ＡＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＰａｒｔｉａｌＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｅｕｉｒｅｍｅｎｔｓｑｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＧｅｎｅＭｉｎｉｎｇＣｌｏｎｉｎａ

2、ｎｄＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ，ｇｐＣａｒｂｏｎｌＲｅｄｕｃｔａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓｙＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＴａｏＲｕａｎＭａｏｒ：ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｉｎｅｅｒｉｎａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｊｇｇｇｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｈｏｎｈｕａＹａｎｇｇＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００８１，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＭａ２０１８ｙ，武漢科技大學(xué)研究生學(xué)位論文創(chuàng)新性

3、聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除了文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容或?qū)俸献餮芯抗玻崳娡瓿傻墓ぷ魍猓菊撐牟话魏纹渌麄€(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研宄做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處一，本人承擔(dān)切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：日期：研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明本論文的研宄成果歸武漢科技大學(xué)所有，其研宄內(nèi)容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人完全了解武漢科技大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向有關(guān)

4、部門按照《武漢科技大學(xué)關(guān)于研（宄生學(xué)位論文收錄工作的規(guī)定》執(zhí)行）送交論文的復(fù)印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱，同意學(xué)校將本論文的全部或部分內(nèi)容編入學(xué)校認(rèn)可的國(guó)家相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和對(duì)外服務(wù)。論文作者簽名：你熱指導(dǎo)教師簽名：摘要手性醇是工業(yè)合成藥物一種、農(nóng)用化學(xué)品、天然產(chǎn)品及某些特殊材料過程中重要的手性砌塊。利用羰基還原酶不對(duì)稱還原前手性羰基化合物，是合成手性醇一的重要方法之。本文通過構(gòu)建基因挖掘策略，挖掘蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中潛在羰基還。原酶，并進(jìn)行了克隆表達(dá)研究本研宄在確定羰基還原酶各家族的氨基酸保守序列

5、后，選取來(lái)源于極端嗜熱菌中的羰基還原酶（ＡｐＣＲ），作為探針酶。以探針酶的氨基酸序列為模板，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)、篩選后，構(gòu)建候選酶庫(kù)。通過對(duì)候選酶序列和探針序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬比對(duì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬比對(duì)后，確定來(lái)源于蠟樣芽胞桿菌中的蛋白ＢｃＣＲ，與探針ＡＣＲ序列具有相似的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且都具有羰基還原酶ＳＤＲｓ家族的ｐＡＣＲ相似的酶學(xué)性質(zhì)及功能。以５．ｃｅｒｅｉｗ氨基酸保守序列，推測(cè)該蛋白具有與ｐ的基因組ＤＮＡ為模板，ＰＣＲ克隆出ＢｃＣＲ基因（７３８ｂｐ，構(gòu)建重組質(zhì)粒ＥＴ）ｐ－ｃ／２

6、８ａＢＣＲ，并將其導(dǎo)入在五．ｃｏ／Ｂ１２１ＤＥ３ｌｙｓＳ中，實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，蛋白（）ｐ大小約為３２ｋＤａ。°，其最適反應(yīng)溫度為５７，最適對(duì)表達(dá)出的目標(biāo)酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)．５ＣＨ為°７，Ｃ范圍內(nèi)較穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)能明顯促進(jìn)該酶催化能力的反應(yīng)ｐ．０該酶在４０＝ＢＥ的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ｋ＝ｍｍｏ。ｍ．／Ｌ，．金屬離子該酶對(duì)ＣＯ１８５ｌ最大反應(yīng)速率Ｖｍａｘ０２２＿＿ｌ１ｍｏ＿ｍ＿Ｒ與ＡＨｌｉｎｍｇ。目標(biāo)酶的這些酶學(xué)性質(zhì)與基因挖掘過程中ＢｃＣｐＣＲ的比。利用重組菌的全細(xì)胞－對(duì)初步分析結(jié)果基本吻合，催化羰基化合物４氯乙酰乙酸乙酯ＣＯＢＥ

7、還原羰基還原酶的功能性鑒定，還原產(chǎn)物通過氣相色譜進(jìn)行（），進(jìn)行°１３７檢測(cè)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹椋玻埃恚恚铮欤?、菌體濃度為０．ｇ／ｍＬ時(shí)，Ｃ反應(yīng)２０ｈ后，ａ＞０－７，產(chǎn)物構(gòu)型為產(chǎn)率達(dá)到６．７％。羰基還原的產(chǎn)物旋光值（Ｒ）ＣＨＢＥ。一本文構(gòu)建了一種羰基還原酶的基因挖掘策略，利用該方法成功獲得了種來(lái)。源于５．ｃｅｗｔｗ的新型羰基還原酶ＢｃＣＲ，為獲取高效羰基還原酶提供基礎(chǔ)研究，與傳統(tǒng)的獲取羰基還原酶的方法相比，基因挖掘顯得更高效前景更廣。關(guān)鍵詞：手性醇；基因挖掘；羰基還原酶；原核表達(dá)；不對(duì)稱還原ＩＡｂｓｔｒａｃｔＣｈｉ

8、ｒａｌａｌｃｏｈｏｌｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｉｒａｌｂｌｏｃｋｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｈ