Bacillus cereus中羰基還原酶的基因挖掘及克隆表達研究

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1、分類號０８１２學號２０１５２２７０３０３２學校代碼１０４８８密級公開碩士學位論文Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ中羰基還原酶的基因挖掘及克隆表達研究學位申請人：阮濤學科專業(yè)：化學工程與技術指導教師：楊忠華教授答辯日期：２０１８年５月２０日ＡＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＰａｒｔｉａｌＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｅｕｉｒｅｍｅｎｔｓｑｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＧｅｎｅＭｉｎｉｎｇＣｌｏｎｉｎａ

2、ｎｄＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ，ｇｐＣａｒｂｏｎｌＲｅｄｕｃｔａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓｙＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＴａｏＲｕａｎＭａｏｒ：ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｉｎｅｅｒｉｎａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｊｇｇｇｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｈｏｎｈｕａＹａｎｇｇＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００８１，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＭａ２０１８ｙ，武漢科技大學研究生學位論文創(chuàng)新性

3、聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下，獨立進行研究所取得的成果。除了文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容或?qū)俸献餮芯抗玻崳娡瓿傻墓ぷ魍?，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研宄做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。申請學位論文與資料若有不實之處一，本人承擔切相關責任。論文作者簽名：日期：研究生學位論文版權使用授權聲明本論文的研宄成果歸武漢科技大學所有，其研宄內(nèi)容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人完全了解武漢科技大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向有關

4、部門按照《武漢科技大學關于研（宄生學位論文收錄工作的規(guī)定》執(zhí)行）送交論文的復印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱，同意學校將本論文的全部或部分內(nèi)容編入學校認可的國家相關數(shù)據(jù)庫進行檢索和對外服務。論文作者簽名：你熱指導教師簽名：摘要手性醇是工業(yè)合成藥物一種、農(nóng)用化學品、天然產(chǎn)品及某些特殊材料過程中重要的手性砌塊。利用羰基還原酶不對稱還原前手性羰基化合物，是合成手性醇一的重要方法之。本文通過構建基因挖掘策略，挖掘蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中潛在羰基還。原酶，并進行了克隆表達研究本研宄在確定羰基還原酶各家族的氨基酸保守序列

5、后，選取來源于極端嗜熱菌中的羰基還原酶（ＡｐＣＲ），作為探針酶。以探針酶的氨基酸序列為模板，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對、篩選后，構建候選酶庫。通過對候選酶序列和探針序列進行氨基酸序列比對、二級結構模擬比對、三級結構模擬比對后，確定來源于蠟樣芽胞桿菌中的蛋白ＢｃＣＲ，與探針ＡＣＲ序列具有相似的二級、三級結構，并且都具有羰基還原酶ＳＤＲｓ家族的ｐＡＣＲ相似的酶學性質(zhì)及功能。以５．ｃｅｒｅｉｗ氨基酸保守序列，推測該蛋白具有與ｐ的基因組ＤＮＡ為模板，ＰＣＲ克隆出ＢｃＣＲ基因（７３８ｂｐ，構建重組質(zhì)粒ＥＴ）ｐ－ｃ／２

6、８ａＢＣＲ，并將其導入在五．ｃｏ／Ｂ１２１ＤＥ３ｌｙｓＳ中，實現(xiàn)了可溶性表達，蛋白（）ｐ大小約為３２ｋＤａ。°，其最適反應溫度為５７，最適對表達出的目標酶進行酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)．５ＣＨ為°７，Ｃ范圍內(nèi)較穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)能明顯促進該酶催化能力的反應ｐ．０該酶在４０＝ＢＥ的動力學參數(shù)Ｋ＝ｍｍｏ。ｍ．／Ｌ，．金屬離子該酶對ＣＯ１８５ｌ最大反應速率Ｖｍａｘ０２２＿＿ｌ１ｍｏ＿ｍ＿Ｒ與ＡＨｌｉｎｍｇ。目標酶的這些酶學性質(zhì)與基因挖掘過程中ＢｃＣｐＣＲ的比。利用重組菌的全細胞－對初步分析結果基本吻合，催化羰基化合物４氯乙酰乙酸乙酯ＣＯＢＥ

7、還原羰基還原酶的功能性鑒定，還原產(chǎn)物通過氣相色譜進行（），進行°１３７檢測。當?shù)孜餄舛葹椋玻埃恚恚铮欤?、菌體濃度為０．ｇ／ｍＬ時，Ｃ反應２０ｈ后，ａ＞０－７，產(chǎn)物構型為產(chǎn)率達到６．７％。羰基還原的產(chǎn)物旋光值（Ｒ）ＣＨＢＥ。一本文構建了一種羰基還原酶的基因挖掘策略，利用該方法成功獲得了種來。源于５．ｃｅｗｔｗ的新型羰基還原酶ＢｃＣＲ，為獲取高效羰基還原酶提供基礎研究，與傳統(tǒng)的獲取羰基還原酶的方法相比，基因挖掘顯得更高效前景更廣。關鍵詞：手性醇；基因挖掘；羰基還原酶；原核表達；不對稱還原ＩＡｂｓｔｒａｃｔＣｈｉ

8、ｒａｌａｌｃｏｈｏｌｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｉｒａｌｂｌｏｃｋｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｈ