分子克隆載體

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1、分子克隆載體周俊宜fzyxzjy@126.com基因工程的表達體系操縱子理論在基因工程中的應用目的基因翻譯表達及其準確性常用基因載體基因載體是一類能自我復制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細胞。常用的載體有質粒、噬菌體、病毒基因工程的表達體系原核生物表達體系：大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌大腸桿菌表達體系的優(yōu)點：積累了充足經(jīng)驗，有數(shù)不清的載體可供應用；可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因

2、先在原核體系上構建克隆，稱為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式轉移至真核細胞上表達。缺點：原核生物載體構建的重組體是無法進入動物細胞進行表達；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內毒素不易除去；常會形成包涵體。表達體系的發(fā)展表達體載體宿主第一代原核生物表達體系質粒、噬菌體細菌第二代酵母表達體系穿梭質粒酵母第三代哺乳類細胞表達體系病毒、脂質體培養(yǎng)細胞第四代基因直接導入DNA本身生殖細胞、體細胞、個體基因工程的目的是使目的基因能高效表達?；虮磉_受DNA結構、蛋白質因子與核酸相互辨認、結合等組成的表達體系的調

3、控?；虮磉_調控可在轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等水平進行基因工程載體的構建必需應用表達調控的基本理論知識，應用已知的調控序列進行重組、改造。操縱子理論在基因工程的應用一、啟動子與轉錄調控原核生物的轉錄單位是操縱子，操縱子包括相關結構基因及其上游的調控序列。結構基因調控序列操縱子P：啟動序列O：操縱序列I：調節(jié)序列IPOCAP調控區(qū)ZYX結構基因以乳糖操縱子（lacoperon）為例：誘導物ZYXIPOCAPZYXIPOCAP二、強啟動子的構建開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowb

4、ox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205?3?3?5?原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)5?5?RNA聚合酶保護區(qū)結構基因3?3?RNA轉錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列TAT

5、A盒CAAT盒GC盒增強子順式作用元件結構基因-GCGC---CAAT---TATA轉錄起始真核生物啟動子保守序列RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合Ptac啟動子Ptrp與Plac的雜化產(chǎn)物Ptac比原來各自的活性強-35區(qū)-10區(qū)PtrpTTGACATTAACT共有序列TTGACATATAATPtac17TTGACATATAAT乳糖操縱子的天然誘導物是乳糖乳糖類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更強的誘導作用。IPTG配合使用在基因工程可作藍白斑篩選。LacZ基因編碼的乳糖苷酶X-gal藍色吲

6、哚產(chǎn)物三、藍白斑試驗（IPTG-Xgal試驗）誘導物ZYXPOZYXPO乳糖標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H?片段COOH?片段lacZX-galLacZ藍色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶轉錄終止：非依賴ρ因子的轉錄終止需要莖環(huán)結構，以t（termination）代表。CGGCCGCGGCCUAAUGA5’…AUACCAUUUUUUUUU…3’四、轉錄終止結構的插入莖環(huán)結構使轉錄終止的機理使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄復

7、合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG5?3?3?5?RNA-pol五、增強子轉錄起始前-30區(qū)為TATA盒，還有多種順式作用組件相互配搭成啟動子。增強子遠距離地、不同方向地控制啟動子的活性。增強子的核心序列是TGTGGAATTAG。增強子的作用特點有：非特異性遠距離操縱、多方向性。酵母結構基因的上游還有上游活化序列（upstreamactivationsequence，UAS）。目的基因翻譯表達及其準確性核糖體結合位點（S-D序列）mRNA有與核糖體DNA結合的位點S-D序列(Shine-Dalgar

8、no)，又稱為核糖體結合點。3’…ACACUAGG…5’16sRNAUCU-C-C-U5’……AGGAPuPuUUUPuPu…AUGmRNAAGGA后的的7個Pu是核糖體小亞基的辨認部位lF1、3met-GTP-lF230S50SGDP+PilF2,fmetfmet30S50SlF1、3mRNAGTP基因克隆時的定向插入插入序列兩邊的酶切口不同,插入的組件不會倒裝，保證了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正