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《實驗二 總糖和還原糖測定(dns)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實驗二總糖和還原糖的測定──3,5－二硝基水楊酸比色法?一、目的要求：?掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習用比色法測定還原糖的方法。?二、實驗原理:?在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。???三、試劑和器材?1、試劑3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取5.0gDNS溶于200ml2mol/LNaOH溶液中（不適宜用高溫促溶），接著加入到酒石
2、酸甲鈉的熱溶液中（192g就是酸甲鈉溶于500ml水中），再加入5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，搖勻溶解后，冷卻定容至1000ml，暗處保存?zhèn)溆谩Ｆ咸烟菢藴嗜芤海簻蚀_稱取在105℃的溫度下烘干至恒重的葡萄糖0.5g，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至1000ml。6mol/LHCl：取250ml濃HCl（35%～38%）用蒸餾水稀釋到500ml。碘－碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。6NNaOH：稱取120gNaOH溶于500ml蒸餾水中。0.1%酚酞指示劑：0.1g酚酞溶于100ml無水乙醇中。1％淀粉2、材料淀粉。?3、器材WF
3、JUV－2000型分光光度計，水浴鍋，電爐，10ml比色管。四、操作方法?1、葡萄糖標準曲線制作取6支10ml比色管并編號，按下表順序加入各種試劑。（表1）試管號0（空白）12345葡萄糖標準液/mL0.00.10.20.30.40.5蒸餾水/mL0.50.40.30.20.10.0DNS試劑/mL0.50.50.50.50.50.5葡萄糖含量/mg0.00.050.100.150.20.25A540混勻后置沸水浴上加熱5min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水4.0mL，搖勻（用10mL比色管，加蒸餾水補齊至5mL刻度線），在540nm波
4、長下，用0號管調(diào)零，分別讀取各管的吸光度值A(chǔ)540。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。??2、淀粉水解及還原糖的提取取1％淀粉25mL，放在100mL燒杯中，加入6mol/LHCl10mL，然后加入蒸餾水15mL，混勻，于沸水浴中保溫30min，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100mL，從中取10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于還原糖
5、測定。?4、樣品中含糖量的測定取3支10ml比色管，分別按下表加入試劑：（表2）項目空白淀粉水解液067樣品溶液/mL00.50.5DNS試劑/mL0.50.50.5蒸餾水/mL0.500?注：0號管同表1中0號管；6號、7號為淀粉水解液平行實驗。加完試劑后，于沸水浴中加熱5min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水4.0mL，搖勻（用10mL比色管，加蒸餾水補齊至5mL刻度線），在540nm波長處測定光吸收值。測定后，取樣品的光吸收平均值在標準曲線上查出相應(yīng)的糖量。?5、結(jié)果處理按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：式中：C──還原糖或
6、總糖提取液的濃度，mg/ml；V──還原糖或總糖提取液的總體積，ml；m──樣品重量，g；1000──mg換算成g的系數(shù)。??五、注意事項?標準曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進行，一起顯色和比色?思考題1.比色時為什么要設(shè)計空白管？2.比較費林試劑比色法與3,5-二硝基水楊酸比色法測定可溶性淀粉中還原糖和總糖的結(jié)果，這兩種方法各有何優(yōu)點？
