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1、Humanin的基因克隆及序列測定靳輝，王唯析，楊廣笑，王全穎，胡海濤，韓太真【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病作者簡介：靳輝(1973)，女(漢族),解剖學(xué)碩士.研究方向：阿爾茨海默病的病理機(jī)制及防治. 摘要：目的利用基因工程方法對Humanin進(jìn)行基因克隆并測定其序列，為進(jìn)一步對阿爾茨海默病進(jìn)行基因治療奠定基礎(chǔ)。方法采用非對稱互補(bǔ)引物/模板法，制備兩端含有酶切位點(diǎn)的Humanin的cDNA，將其克隆入pVAXI載體中并測序。結(jié)果經(jīng)酶切鑒定、測序分析，表明所插入的基因片斷為Humanin基因，與設(shè)計(jì)完全相同。結(jié)論成功地克隆
2、了Humanin基因?！ ￡P(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；Humanin；基因克?。恍蛄袦y定 ABSTRACT:ObjectiveTousegeneengineeringtechniquetocloneandsequencetheHumanin.MethodsBymeansofasymmetricalprimer/template,doublestrandedcDNAofHumaninessitesonthetes.ThenthecDNAidpVAXIandsequenced.ResultsEvidencesofDNAse
3、quenceanalysisandrestrictionenzymesdigestionshoentanincDNA,consistententanincDNAer'sdisease;Humanin;genecloning;sequencing阿爾茨海默病(Alzheimersdisease,AD)是以進(jìn)行性的記憶減退、認(rèn)知障礙和癡呆為臨床表現(xiàn)的老年人常見疾病，發(fā)病率隨著人口的老齡化而迅速增加，已成為繼心血管疾病、癌癥和中風(fēng)之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前世界各國均在積極尋找防治AD的有效措施。近年，日本學(xué)者
4、首先從AD患者未發(fā)病的大腦枕葉分離出一種稱為Humanin(HN)的短肽。它能有效抑制AD相關(guān)基因：淀粉樣蛋白前體(amyloidprecursor,APP)基因、早老素1(presenilin1,PS1)基因、早老素2(presenilin2,PS2)基因的突變，以及β淀粉樣肽(amyloidpeptide,Aβ)引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡，且Humanin的一種衍生物──Humanin(HNG)，被證實(shí)作用較HN強(qiáng)1000倍。迄今，Humanin及其衍生物的作用機(jī)制仍不十分清楚。為了深入研究其對AD的作用機(jī)制以及為開發(fā)
5、新的更為有效的抗AD藥物提供參考，我們首次在國內(nèi)對HNG進(jìn)行基因克隆?！ ?材料與方法 1.1材料大腸桿菌E.coliDH5α、質(zhì)粒載體pVAXI由西安華廣生物工程公司提供。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ、SalⅠ及T4DNA連接酶，均購自華美生物工程公司?！ ?.2HNGDNA的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Hashimoto等人提供的HN基因序列，將其第14位絲氨酸堿基AGT換為甘氨酸堿基GGG，形成HNG基因序列，在其前后分別加入質(zhì)粒載體pVAXI多克隆位點(diǎn)上的兩個單一酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XhoⅠ，并在HNG基因編碼區(qū)的下游
6、引入了一個載體上沒有的酶切位點(diǎn)SalⅠ。設(shè)計(jì)HNG非全長、部分互補(bǔ)的兩條單鏈DNA，使其互為引物、互為模板制備全長HNGcDNA。序列如下：正鏈：CGGTACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCGGGGAAATTG；負(fù)鏈：GCCTCGAGCGTCGACTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCCCCGG(正鏈中GGTACC為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，GGG為第14位甘氨酸的編碼堿基；負(fù)鏈中CTCGAG、GTCGAC分別為XhoⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)；下劃線部分為1
7、2個互補(bǔ)堿基)。以上序列均由上海生物工程有限公司合成，PAGE純化?！ ?.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建將上述正負(fù)鏈退火后再以Klenoarker前方，大片段位于λDNA/HindⅢmarker2322bp與4361bp之間(圖2C)，此兩片斷與理論值81bp及2935bp相符。此6份質(zhì)粒用SalⅠ消化，可見質(zhì)粒被線性化，只有一條條帶(圖2D)，位置與未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒(圖2E)相近(圖2)。圖2pVAXI/HNG重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜（略） 2.3測序結(jié)果采用電腦DNA分析輔助軟件，將上海生物工程有限公司測定的基因序列進(jìn)行分
8、析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與設(shè)計(jì)完全相同。 3討論 HN是一種新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)保護(hù)肽，含24個氨基酸殘基(MetAlaProArgGlyPheSerCysLeuLeuLeuLeuThrSerGluIleAspLeuProValLysArgArgAla)，其基因序列首先由日本研究者Hashimoto等人從尸檢診斷為AD病病人未發(fā)病的枕葉cDNA文庫中篩查得出，其mR
