比格犬注射重組腺病毒adhgf后血清中抗腺病毒抗體及中和抗體的檢測

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1、比格犬注射重組腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗體及中和抗體的檢測作者：哈小琴,趙治華,呂同德,勞妙芬,吳丹莉,吳祖澤【摘要】目的：觀察Beagle犬重復給予AdHGF后血清中抗腺病毒抗體及抗肝細胞生長因子（hepatocytegroo齡，體質量6~7.5kg，雌雄各半（軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心）.AdHGF(攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒)，AdGFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒)和293細胞（以腺病毒E1基因轉化的人胚腎細胞系）均由軍事醫(yī)學科學院二所三室提供.鼠抗人HGFmAb（RD），

2、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc),重組人HGF蛋白純品（RD）,DMEM(Gibco),小牛血清（天津血研所）,猴抗血清（軍事醫(yī)學科學院五所昭衍新藥研究中心），潔凈工作臺（北京半導體設備一廠），CO2培養(yǎng)箱（Sanyo）,IX70倒置熒光顯微鏡（Olympus）,PM30自動照相系統(tǒng)（Olympus）.　　1.2方法　　1.2.1動物分組設正常對照組、手術對照組、AdHGF小劑量組(2.4×107pfu/kg,擬臨床用量3.4倍)和大

3、劑量組(2.4×108pfu/kg,擬臨床用量34倍)，每組6只.　　1.2.2給藥途徑采用心肌注射和臀部肌肉注射相結合,首次心肌注射，其余13次為肌肉注射給藥.給藥期限為7o.　　1.2.3犬血清中抗腺病毒抗體測定利用病毒中和反應方法，即病毒與抗血清中和后，將其感染細胞，細胞不產生病變?yōu)榭瓜俨《究贵w陽性，反之細胞出現(xiàn)病變?yōu)榭瓜俨《究贵w陰性，并觀察綠色熒光是否出現(xiàn).將293細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，5×104個/孔.次日感染病毒（AdGFP）與血清的混合液:取20μL犬血清加8u的青霉素，再加5×106pf

4、u病毒,相當于100MOI(multiplicityofinfection,感染強度)，混勻后37℃水浴30min.吸棄原培養(yǎng)液，加入上述混合液，每個樣品雙份，每孔加入200μL，以小牛血清加病毒液作陰性對照,猴抗血清為陽性對照，置37℃，50mL/LCO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育.24，36，48h觀察熒光及CPE(細胞病變效應).　　1.2.4犬血清中中和抗體測定用ELISA方法測定血清中抗HGF抗體水平.收集穩(wěn)定分泌表達HGF的CHO細胞的培養(yǎng)上清作為抗原，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗，新鮮配制的OPD為

5、底物顯色液，測A490nm值.同時用抗HGFmAb作一標準曲線，以計算抗體的滴度.　　2結果　　2.1血清抗腺病毒抗體檢測共12次采血，受試動物212只次，手術對照組及正常對照動物血清均出現(xiàn)明顯CPE及強熒光(圖1).給藥前及給藥2次后24h的血清也出現(xiàn)明顯的陽性結果.給藥4次后大劑量組5只動物血清均對腺病毒有中和作用(圖2A)，小劑量組3只動物也已檢測到抗體.給藥6次后，動物全部檢測到高滴度抗體(圖2B).停藥后4.　　3討論　　腺病毒載體是繼逆轉錄病毒載體之后在基因治療中廣為應用的一種基因轉移載體，可感染種類

6、相當廣泛的有絲分裂后細胞，甚至包括來自高度分化的組織中的細胞，例如骨骼肌細胞、肺細胞、腦細胞和心肌細胞.該病毒有以下優(yōu)點［3-6］：①對人類安全，無致畸、致病及致癌性；②對分裂細胞及癌細胞株的轉染效率達到90%～100%；③腺病毒感染細胞時DNA不整合到宿主細胞染色體中；④腺病毒容易制備、純化和濃縮，可達到較高滴度；⑤腺病毒載體插入外原基因的容量較大，所以目前國外多用復制缺陷的腺病毒為載體介導p53基因轉移.p53基因治療的研究雖然取得了一定的成績，也存在不少問題.最突出的問題為抗體的產生,病毒載體均可引起抗體產

7、生.腺病毒能引發(fā)強烈的免疫反應，在第一次感染后兩etovDM,GaggarA,NiS,etal.Adenovirusbindingtobloodfactorsresultsinlivercellinfectionandhepatotoxicity［J］.JVirol,2005,79(12):7478-7491.　?。?］PandoriM,HobsonD,SanoT.Adenovirusmicrobeadconjugatespossessenhancedinfectivity:aneE.Rebinantadeno

8、virusvectorsforgenetherapyandclinicaltrials［J］.ActaMicrobiolImmunolHung,2001,48(34):323-348.　?。?］AdamE,NaszI.AdenovirusvectorsandthEIrclinicalapplicationingenetherapy［J］.OrvHetil,2001,14