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1、實驗名稱(TitleofExperimetn)蛋白質的定量測定（Folin-酚試劑法）實驗日期(DateofExperiment)XXXX實驗地點(LabNo.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導老師(Instructor)XXXX總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期(Date)一、實驗預習1.0實驗目的l初步了解各種蛋白質含量測定的常用方法。l掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質含量的原理及熟悉和掌握實驗操作技術。l掌握用excel制作標準曲線和通過標準曲線及標準管方法求樣品溶液中待測定物質含量。1.1實驗原理1.1.
2、1總體概述Folin-酚試劑法是經過科學家改進的測定蛋白質含量的方法，Folin首創(chuàng)這種方法：利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應。而后，Lowry對此法進行了改進，先于標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應，提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：，故使得實驗的精確度大大提高，但同時也存在著干擾物質多、費時、操作嚴格計時等問題。1.1.2雙縮脲反應在堿性溶液中，雙縮脲（）能和作用，發(fā)生配位反應，形成紫色或紫紅色的絡合物，即為雙縮脲反應。由于蛋白質的肽鍵結構與雙縮脲結構相似，故在堿性溶液中，蛋白質的分子中肽鍵能和堿性銅試劑中的作
3、用，生成紫紅色的蛋白質-復合物。對于蛋白質的測定來說，這一步是基礎，這也是Folin-酚法的基礎原理。1.1.3Folin-酚顯色反應Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原而呈現藍色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質-復合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。在一定的濃度范圍內，藍色的深淺與蛋白質的濃度呈線性關系。故可以利用上述兩種反應通過分光光度法測定待測樣品的蛋白質含量。1.1.4分光光度法測定樣品的蛋白質的含量本實驗以上述兩個反應原理為基礎，再通過設置空白對照組，標準管中設
4、置蛋白標準液的一系列濃度梯度（，，，）通過分光光度計測定吸光度，從而獲取標準曲線，樣品管通過測定的吸光度值，在標準曲線中找到較為準確對應的含量。1.2實驗材料1.2.1實驗樣品①血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）1.2.2實驗試劑①200mg/ml牛血清白蛋白標準液（BSA）；②堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時該溶液必須新鮮配制，當日有效）；③Folin-酚試劑（配制過程較為復雜）注：此次實驗所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實驗書P105。1.2.3實驗儀器及器材①V-1100可見光分
5、光光度計；②恒溫水浴箱；③試管6支、試管架；④加樣槍、加樣槍架。1.3實驗步驟1.3.1實驗流程溶液混合滴加堿性硫酸銅靜置10min加入Folin-酚試劑水浴10min比色測定繪圖取結果1.3.2實驗步驟步驟操作（1）反應體系設置取6只潔凈的試管，利用加樣槍按要求量取相應量的溶液，混合均勻（各試管的需加入的試劑和量見下表）：試劑空白管標準管樣品管123456牛血清蛋白質標準液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5（2）雙縮脲反應每隔一分鐘，依次往1號試管到6號試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每
6、支試管的加入硫酸銅時間，室溫靜置10min（3）Folin-酚反應①將靜置時間達到10min中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻（一般在2s以內）。②在40下水浴加熱10min鐘同樣需計時。③10min鐘后取出冷卻至室溫。（4）比色測定①轉動波長旋鈕，調制500.0nm，按“mode”鍵切換到T檔，分別將1-6號試管中混合液放入比色杯中利用1號試管為空白，校置100；②調至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數據。③重復操作，再讀取數據2次，并記錄。數據表格見表1（5）繪制標準曲線利用測得的數據，繪制以值為縱坐標，牛血清清蛋白標準液
7、濃度為橫坐標的準備曲線，具體繪制利用excel制作，結果可見圖2（6）測樣品蛋白質含量根據樣品管（6管）的吸光度值，在標準曲線中找到對應的蛋白質濃度，再乘以稀釋倍數（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質的微克數，即每毫升血清中蛋白質的微克數(mg/ml)。血清蛋白濃度(mg/ml)=樣品蛋白質濃度×2×300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為60~80g/L。1.3.3注意事項①試劑要求：實驗所需的試劑必須是新鮮配制，不然會存在被空氣及其他物質氧化還原的情況，干擾實驗的測定。②控制時間：Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。嚴格按照
8、實驗步驟的操作，規(guī)定的時間是多少就多少。水浴時間也不
