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1、壁虎醇提物對人食管癌細胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達的影響論文王曉蘭王建剛宋佳玉李瑞芳【摘要】目的研究壁虎醇提物對人食管鱗癌細胞株EC9706的生長抑制作用及其機制。方法通過MTT法檢測不同濃度、不同時間壁虎醇提物對人食管鱗癌細胞的生長抑制作用;倒置顯微鏡觀察不同濃度壁虎醇提物作用細胞24h后細胞形態(tài)的改變;吉姆薩染色后光學顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)改變;SP免疫組化法檢測細胞內凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達。結果6～8mg/ml壁虎醇提物作用于細胞24，48，72h后能夠明顯抑制EC9706食管鱗癌細胞株的生長(P0.01,與陰性對照比較)，抑制率分別為13%～
2、76%,37%～88%,54%～93%,抑制作用呈劑量和時間依賴性;Geimsa染色可見凋亡細胞;免疫組化結果顯示,壁虎醇提物(6,7mg/ml)處理細胞24h后，與陰性對照組比較，細胞內Bcl-2蛋白無明顯變化，而Bax蛋白表達升高，Bax/Bcl-2比值升高。結論壁虎醇提物能夠抑制EC9706細胞的增殖并誘導其凋亡.freela公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉劑(Sigma公司);二甲基亞砜(天津市化學制劑廠);鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術公司)。1.4儀
3、器二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);倒置顯微鏡XSZ-D2型(重慶光學儀器廠);超凈工作臺SP-DJ-2B型(浙江省金沄市榮華儀器制造有限公司);ZS-板式酶標儀(中科院生物物理所制造);86-3型超聲儀(上海超聲波儀器廠);旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);冷凍干燥儀(德國MARTINCHRIST公司);96、6孔培養(yǎng)板為美國Costar公司產品。2方法2.1藥物提取及配制2.1.1壁虎醇提物的提取取干壁虎1000g粉碎，加入一定體積預冷的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)浸泡過夜后超聲30min，超低溫離心機離心(8500r/min,20min)，取上清，
4、加入無水乙醇使其終濃度為55%,4℃放置并攪拌(每30分鐘攪拌1次)，4h后離心(8500r/min,20min)，取上清，真空旋轉蒸發(fā)(55℃)回收乙醇，濃縮液冷凍干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。以上操作均4℃條件下進行。2.1.2藥物配制將壁虎醇提物以RPMI1640完全培養(yǎng)液配置8mg/ml母液，0.22μm微孔濾膜過濾,母液稀釋得7.5，7，6.5，6，5.5mg/ml供實驗用,以上藥物均實驗前新鮮配用。2.2MTT法6測定藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用EC9706細胞株生長于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中,.freell接種于96孔培養(yǎng)板，每孔1
5、00μl，實驗分3組，即實驗組、陰性對照組、陽性對照組，每組設5個復孔并設空白調零孔。將接種EC9706細胞的培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去原有的培養(yǎng)液,實驗組分別加入各200μl的6種不同濃度壁虎醇提物,陰性對照組加200μl培養(yǎng)液,陽性對照孔組加終濃度為20μg/ml絲裂霉素C200μl,混勻后置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48,72h后取出培養(yǎng)板，每孔加入20μl濃度為5mg/ml的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h終止培養(yǎng),吸去孔內上清液，每孔加入二甲基亞砜150μl,置37℃搖床中10min,使結晶物充分溶解后在酶聯(lián)檢測儀于4
6、90nm波長處測定各孔光密度值(OD值),并按下式計算抑制食管癌細胞的百分率。抑制率(%)=(陰性對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/陰性對照組平均OD值×100%2.3細胞形態(tài)學觀察96孔板細胞接種方法同MTT法，分別加入5.5，6，6.5，7，7.5，8mg/ml濃度壁虎醇提物作用24h后，取出96孔板在倒置顯微鏡觀察每孔細胞形態(tài)改變，拍照。細胞爬片后，按常規(guī)方法用吉姆薩染色，于光學顯微鏡鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學改變。2.4S-P法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液后，以1×105個/ml的細胞濃度接種于內含有
7、蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，24h細胞貼壁后換用新鮮培養(yǎng)液，實驗設對照組和藥物組，實驗組加入6，7mg/ml壁虎醇提物2ml，陽性組加入2ml絲裂霉素C,使其終濃度為20μg/ml,陰性對照組加入同體積的RPMI1640培養(yǎng)液，24h后取出6孔板，細胞爬片用PBS浸洗，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS浸洗;0.3%Trixon-100通透液通透30min,PBS浸洗;每張爬片滴加1滴3%過氧化氫，孵育10min，以阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS浸洗;每張爬片滴加1滴封閉用非免疫性動物血清，室溫下孵育10min，吸去多余液體;每張爬片滴加1滴鼠抗人B
