遠志種質資源遺傳多樣性隨機擴增多態(tài)性dna分析

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1、遠志種質資源遺傳多樣性隨機擴增多態(tài)性DNA分析【摘要】目的用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術分析遠志PolygalatenuifoliagCl22.0μl,引物1.0μl,模板2ng,Taq酶0.3μl。擴增程序為：94℃預變性4min，然后進行45循環(huán)：94℃變性15s，36℃復性1min，72℃延伸1.3min，循環(huán)結束后72℃延伸4min。結果10個引物共檢測到154個位點，平均每個引物擴增9.24條帶，其中148條帶表現(xiàn)為多態(tài)性，占總帶數(shù)的94.3％；距離系數(shù)為24時，11個樣品明顯聚為遠志居群和卵葉遠志居群兩類。結論遠志與卵葉遠志具有豐富的遺傳多樣性，遺傳聚類與其地理分布

2、有一定的相關性?！娟P鍵詞】遠志；卵葉遠志；遺傳多樣性；隨機擴增多態(tài)性DNA　　Abstract:ObjectiveToanalyzegeicdiversityofPolygalatenuifoliayCyclerTMThermalCycler（德國）；ThermeElectronTM加樣器?！　?.2試劑　　10mer隨機引物（北京賽百盛基因技術有限公司），λ-EcoT14IdigestDNAMarker(TakaRa)，DNAMarker15000(TakaRa)，DNAMarker2000(TakaRa)，Taq酶(TaKaRa)2500U，dNTPs(TaKaRa)2.5mmol

3、/L，MaCl2(TaKaRa)25mmol/L，10×Buffer（Mg2＋free）(TaKaRa)，CTAB(Amresco)，PVP(Sigma)，β-巰基乙醇(Sigma)，瓊脂糖（上海YITO生物儀器有限公司分發(fā)），其余為國產(chǎn)試劑。　　1.3材料　　分別從四川、甘肅、陜西、山西、河北等地采得遠志P.tenuifoliag用硅膠干燥的遠志葉片，置-70℃冰箱冷凍1h，取出后在研缽中快速磨成粉末，迅速將粉末轉入1.5ml離心管中，加入700μlCTAB提取液，置65℃金屬浴中30min，其間不時搖動。②取出冷卻至室溫，加等體積氯仿/異戊醇（24∶1），混勻后于12000g/mi

4、n離心10min。③取上清液，重復操作②。④取上清，加入2/3體積的異丙醇，于-20℃放置30min，于10000g/min離心10min，去上清。⑤用80％乙醇洗沉淀2次，風干沉淀。⑥將沉淀溶于100μlddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎媚z自動成像系統(tǒng)照相，檢測DNA的質量和含量，取2μl加樣緩沖液（6×Buffer）與10μlDNA樣品混合，在0.9％瓊脂糖凝膠上以5V/cm電壓條件下電泳，在紫外燈下觀察電泳凝膠。用凝膠自動成像系統(tǒng)照相，用TotalLab軟件分析凝膠圖像，定量?；蚪MDNA電泳圖譜見圖1?！　?.2RAPD擴增條件的建立　　分別對模板DNA濃度、引物濃度、Mg

5、2+濃度、dNTP濃度、Taq酶用量等RAPD擴增條件進行優(yōu)化。最終確定反應體系為：反應總體積25μl，內(nèi)含10×PCRbuffer2.5μl，dNTPs2.0μl，MgCl22.0μl，引物1.0μl，模板2ng，Taq酶0.3μl。擴增程序為：94℃預變性4min，然后進行45循環(huán)：94℃變性15s，36℃復性1min，72℃延伸1.3min，循環(huán)結束后72℃延伸4min，-4℃保存。擴增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓5V/cm，電泳緩沖液為1×TAE。反應產(chǎn)物以DNAMarker2000為分子量標記，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照像、記錄?！　?.3引物篩選　　利用建立的RAPD

6、條件，對40條10bpRAPD隨機引物進行篩選，選擴增條帶清晰、多態(tài)性強的10條引物作為RAPD引物。篩選引物的堿基序列見表2?！　?.4數(shù)據(jù)處理　　每個樣品電泳條帶按有或無記錄，電泳條帶存在時賦值為1。否則賦值為0。利用SPSS10.0按Nai＆Li(1979)的方法計算材料間遺傳相似系數(shù)(GS)。計算公式為：GS=2Nxy/(Nx+Ny)，其中Nxy為材料x和y共有的擴增片段數(shù)目，Nx、Ny為材料x、y中出現(xiàn)的擴增片段總數(shù)目。根據(jù)遺傳距離，按UPGMA法，選擇類間平均連鎖法（Bet〕.北京：科學出版社，2001：18.