鱖魚(yú)肌球蛋白重鏈基因原核表達(dá)和多克隆抗體制備

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1、嫩魚(yú)肌球蛋白重鏈基因原核表達(dá)和多克隆抗體制備摘要肌球蛋白重鏈(MyHC)是肌肉中的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白，在肌肉收縮過(guò)程中起關(guān)鍵作用.根據(jù)蹶魚(yú)肌球蛋白重鏈基因中高親水性區(qū)域DNA設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，將該基因片段亞克隆到pET32a質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中.誘導(dǎo)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株經(jīng)0.8mmol/LIPTG誘導(dǎo)3h可大量表達(dá)融合蛋白.將經(jīng)親和層析純化后的融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體.ELISA和免疫組化測(cè)試結(jié)果表明：此抗體有較好的特異性和抗原性.蹶魚(yú)MyHC基因表達(dá)的研究為深入研究肌球蛋白重鏈的功能特性及其對(duì)肉質(zhì)性狀的影響奠定基礎(chǔ)，為提高魚(yú)類(lèi)肉

2、質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持.關(guān)鍵詞嫩魚(yú)；肌球蛋白重鏈；原核表達(dá)；多克隆抗體中圖分類(lèi)號(hào)Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537(2012)06006707肌球蛋白是肌肉主要構(gòu)成蛋白質(zhì)之一.它由Kuhne于1859年首先報(bào)道，之后于1864年在研究骨骼肌收縮時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名[1].肌球蛋白不僅是基礎(chǔ)蛋白收縮系統(tǒng)主要成分，也是一種復(fù)雜多聚體蛋白，在真核生物肌肉收縮過(guò)程中起到很關(guān)鍵作用[23].在不同的動(dòng)物種類(lèi)之間，乃至魚(yú)類(lèi)不同品種間，肌球蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)存在著種屬間差異性.大部分研究工作主要針對(duì)脊椎動(dòng)物骨骼肌肉(主要是兔和雞)、心臟肌肉、數(shù)種平滑肌而進(jìn)行，同時(shí)也包括部分非肌肉系統(tǒng)肌球蛋白的研

3、究.在魚(yú)類(lèi)中研究較多的是平滑肌組成的心肌肌球蛋白和橫紋肌組成的肌肉肌球蛋白［4］.肌球蛋白不同類(lèi)型的重鏈基因全序列克隆測(cè)序在多種脊椎動(dòng)物中已經(jīng)完成，其中包括大鼠(Rattasnorvergicus)［5］,雞［6］、人［7_以及魚(yú)類(lèi)中的斑馬魚(yú)［8］、大頭魚(yú)、虹鱒［9］、鯉魚(yú)［10］,大黃魚(yú)［11］和嫩魚(yú)［12］等.因此，對(duì)魚(yú)類(lèi)肌球蛋白分子研究已擴(kuò)展到不同魚(yú)類(lèi)品種肌球蛋白重鏈、輕鏈的基因克隆分析及其表達(dá).Lied和Decken采用生物化學(xué)方法分離提取出虹鱒肌球蛋白重鏈，并采用此蛋白作為抗原制備出多克隆抗體，鑒定出其結(jié)合蛋白［11］.Crockford等［13］和Goldspink等［

4、14］采用哺乳動(dòng)物cDNA序列為引物從鯉魚(yú)基因文庫(kù)中克隆出其肌球蛋白重鏈基因，且證實(shí)此類(lèi)基因表達(dá)受環(huán)境因子所控制；Kato和Konno測(cè)定出鯉魚(yú)重鏈氨基末端和輕基末端分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)區(qū)域［15］.有關(guān)魚(yú)類(lèi)肌肉特異性基因肌球蛋白輕鏈(myosinlightchains,MLC)、肌球蛋白重鏈(myosinheavychains,MyHC)的cDNA序列分析所獲取的數(shù)據(jù)，為蛋白質(zhì)和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化分析提供基礎(chǔ).這些克隆和分離的基因已經(jīng)用于研制核酸雜交探針，來(lái)研究肌球蛋白基因家族轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異性組織表達(dá)、進(jìn)化，以及染色體定位或突變等.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)第35卷第6期劉希良等：嫩魚(yú)肌球蛋白重

5、鏈基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備本研究旨在通過(guò)將嫩魚(yú)肌球蛋白重鏈基因片段亞克隆到pET32a質(zhì)粒，構(gòu)建出重組表達(dá)載體，大量誘導(dǎo)表達(dá)此蛋白，制備蹶魚(yú)肌球蛋白重鏈多克隆抗體，為日后分析蹶魚(yú)肌球蛋白重鏈基因表達(dá)對(duì)其肉質(zhì)性狀的影響，進(jìn)而提高魚(yú)類(lèi)肉質(zhì)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持.1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑體重1kg左右的鮮活嫩魚(yú)購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)沙水產(chǎn)市場(chǎng)，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80￡冰箱保存?zhèn)溆?大腸桿菌菌種BL21(DE3)和DH5a均購(gòu)于北京天根公司.原核表達(dá)載體pET32a為本實(shí)驗(yàn)室保存.限制性?xún)?nèi)切酶EcoRl和Hindlll購(gòu)于TAKARA公司；Trizol試劑購(gòu)于Invit

6、rogen公司；100bpMarker.MarkerIlkPCR擴(kuò)增所需的試劑以及一抗AntiHisAntiboby和二抗羊抗鼠購(gòu)于北京天根公司；T4DNA連接酶、低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染及非預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)于Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Promega公司；His融合蛋白純化預(yù)裝柱購(gòu)于上海悅克生物科技有限公司.羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗、DBA顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物公司.其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2試驗(yàn)方法1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)作者已克隆得到的嫩魚(yú)MyHC全長(zhǎng)序列(GenBank：HQ829291)及原核表達(dá)載體pET32a的載體

7、圖譜，利用PrimerPremer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其序列分別為：上游引物P+5'CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3'(雙下劃線部分為引入的EcoRl酶切位點(diǎn)，粗體字為引入的起始密碼子)；下游引物P-5'GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC37(雙下劃線部分為引入的HindIII酶切位點(diǎn)，粗體字為引入的終止密碼子).1.2.2目的基因PCR擴(kuò)增采用Trizol-步抽提法提取蹶魚(yú)肌肉組織的總RNA后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試