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1、AcMNPVel8基因酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄自激活檢測摘要：用PCR方法擴(kuò)增苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultipienucleopolyhedrovirus,AcMNPV)被膜蛋白0DV-E18基因，克隆至酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-el8o將誘餌質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187和AH109感受態(tài)細(xì)胞，被轉(zhuǎn)化細(xì)胞在涂有X-gal的SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上形成白色菌落；在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基上均不形成菌落，表明誘餌基因表達(dá)產(chǎn)物BD-E1
2、8在這兩種細(xì)胞中都不能激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。pGBKT7-el8轉(zhuǎn)化的Y187細(xì)胞在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型液體培養(yǎng)基中的生長速度與空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同，顯示BD-E18對酵母細(xì)胞無細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，AcMNPV0DV-E18可能不直接參與對宿主細(xì)胞或病毒基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，其編碼基因可以作為誘餌基因通過篩查病毒宿主cDNA文庫識別與其相互作用的蛋白質(zhì)。關(guān)鍵詞：苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)；0DV-E18；酵母雙雜交；自激活；細(xì)胞毒性中圖分類號:Q785文
3、獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號:0439-8114(2013)10-2436-03苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是a-屬桿狀病毒的代表種，感染30多種鱗翅目昆蟲，是目前研究得最多的桿狀病毒種［1］。AcMNPV在其復(fù)制周期中產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)和功能不同的病毒體：包含體源病毒體(0DV)和芽殖病毒體(BV)oODV和BV分別執(zhí)行病毒在宿主種群個(gè)體間的傳遞和受感染蟲體內(nèi)的系統(tǒng)感染功能［2］。這兩種病毒體包含序列相同的基因組，但蛋白質(zhì)組成存在差異。目前已經(jīng)鑒定出40多種A
4、cMNPVODV結(jié)構(gòu)蛋白和相似數(shù)目的BV結(jié)構(gòu)蛋白。其中33種結(jié)構(gòu)蛋白共存于0DV和BV病毒體，0DV和BV各有10多種特有蛋白質(zhì)［3,4］。AcMNPV0DV-E18最初被發(fā)現(xiàn)是一種0DV被膜蛋白［5］。最近的研究報(bào)道表明，該蛋白質(zhì)也存在于BV被膜［4］。el8基因存在于所有已完成測序的桿狀病毒基因組，是桿狀病毒33個(gè)核心基因之一。缺el8基因的AcMNPV基因組在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)不能完成BV復(fù)制［6］。其作用機(jī)制尚未明了。為了解el8基因在桿狀病毒復(fù)制過程中的作用，擬通過酵母雙雜交篩選與ODV-E18相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。研究克隆了AcMNPVel8基因開
5、放閱讀框，構(gòu)建了誘餌載體并完成了其在酵母細(xì)胞中的自激活和毒性檢測。1材料與方法1.1材料AcMNPV.酵母AH109和Y187菌株、pGBKT7質(zhì)粒(購自美國Clontech公司)由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購自美國Clontech公司，DNA限制性內(nèi)切酶購自Fermentas(MBI)公司，T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司，PfuDNA聚合酶購自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司。1.2方法1.2.1el8基因PCR擴(kuò)增和誘
6、餌載體的構(gòu)建根據(jù)AcMNPV基因組序列［7］設(shè)計(jì)el8基因開放閱讀框(nt125153-125341)的上游引物el8UP:5'-GGCGAATTCATGTTCTTGACCATCTTG-3'和下游引物el8DN：5'-CTTGCTGCAGTGACCGTTCGAACTTTG-3',以AcMNPVDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。el8UP和el8DN分別對應(yīng)AcMNPV基因組序列nt125153-125170和nt125376-125394o兩者分別附加EcoRI和PstI限制性內(nèi)切酶的識別序列。用EcoRI和PstI分別雙酶切el8基因的PCR產(chǎn)物和pGBKT7載
7、體，將回收的酶切載體和PCR片段進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)成誘餌載體pGBKT7-el8o1.2.2酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及誘餌載體的轉(zhuǎn)化在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線活化釀酒酵母Y187菌株和AH109菌株，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3?4d；挑取生長狀況良好的單菌落接種于3niL的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C.250r/min振蕩培養(yǎng)8h；從中取4uL的菌液接種到25mLYPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C、250r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14?20h,至0D600nm達(dá)到0.15-0.30；離心、棄上清，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50mLYPDA液體培養(yǎng)基中，于30
8、°C、250r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3?6h,至0D6
