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《hsp70誘餌載體的構(gòu)建及其在酵母雙雜交系統(tǒng)中自激活作用的檢測(cè)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、HSP70誘餌載體的構(gòu)建及其在酵母雙雜交系統(tǒng)中自激活作用的檢測(cè)：李靜，楊守京，劉彥仿，周鵬，韓驊【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白70 【Abstract】AIM:Toconstructthebaitvector(pGBKT7Hsp70)ofMATHMAKERGAL4T3,andtestitforitsautonomousactivation.METHODS:Hsp70geneplifiedbyPCRfrompBBS212Hsp70plasmid,andtheEcoRIandBamHIsitesousactivation.CONCLUSION:ThepGBKT7Hsp70ors,;autonomous
2、activation 【摘要】目的：構(gòu)建用于酵母雙雜交系統(tǒng)的“誘餌”載體pGBKT7Hsp70，并檢測(cè)其是否具有自激活作用.方法：用PCR的方法從質(zhì)粒pBBS212Hsp70中擴(kuò)增出Hsp70基因片段，引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ,BamHⅠ.測(cè)序正確后，將Hsp70基因克隆至載體pGBKT7中，并檢測(cè)pGBKT7Hsp70在MATHMAKERGAL4T3中的自激活作用.結(jié)果：成功構(gòu)建了“誘餌”載體pGBKT7Hsp70，并證明其在酵母雙雜交系統(tǒng)中無自激活作用.結(jié)論：pGBKT7Hsp70可以用于酵母雙雜交系統(tǒng)中，尋找與Hsp70相互作用的分子. 【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白70；酵母雙雜交系統(tǒng)；自
3、激活作用 0引言 熱休克蛋白（heatshockproteins,HSPs）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類高度保守的蛋白質(zhì)，它參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)，是細(xì)胞生存所必需的，且也是腫瘤細(xì)胞生存所必需的.反義hsps轉(zhuǎn)染，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡［1-3］.熱休克蛋白70（HSP70）是目前研究得較為深入的一個(gè)家族，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切.為尋找與HSP70相互作用的蛋白，并查明他們的相互作用位點(diǎn)及其體內(nèi)外結(jié)合特性，我們擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行研究，構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體pGBKT7HSP70，并轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，觀察其是否具有自激活作用. 1材料和方法 1
4、．1材料質(zhì)粒pBBS212Hsp70,DH5a菌種均為本室保存.酵母菌AH109為遺傳與發(fā)育教研室保存. DNA重組的各種限制性內(nèi)切酶，pMD18Tvector，T4DNALigase及PCR反應(yīng)系統(tǒng)的LATaqDNA聚合酶，dNTP,10×PCR緩沖液，MgCl2分別購自TaKaRa公司.酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7，酵母培養(yǎng)試劑購自Clontech公司. 1．2方法 1．2．1構(gòu)建誘餌載體(pGBKT7Hsp70)以質(zhì)粒pBBS212Hsp70為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出目的基因Hsp70. 引物設(shè)計(jì)如下：3′GGGGATCCCTAATCT ACCTCCTCAATGGT；5
5、′GCGAATTCGCAGCTGCAATG GCCAAAGCCGCGGCGGCGAT;分別在兩端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ.反應(yīng)總體積為50μL，其中包括：Primer5′0.1mmol，Primer3′0.1mmol,10xbuffer5μL,2.5mmol・L-1dNTP4μL,pBBS212Hsp7050ng,LATag0.5μL,H2O38μL.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min后,95℃1min,55℃1min,72℃1min，循環(huán)30次，最后72℃10min. 將獲得的PCR產(chǎn)物電泳，膠回收后，克隆至載體pMD18Tvector中.酶切鑒定后，送往上海生
6、工測(cè)序.測(cè)序正確后，用EcoRⅠ,BamHⅠ酶切pMD18TvectorHsp70和載體pGBKT7.酶切產(chǎn)物電泳，膠回收目的片斷和載體，通過連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建誘餌載體(pGBKT7Hsp70). 1．2．2制備酵母感受態(tài)將酵母菌AH109菌種劃線接種于YPDA平板上.30℃孵育2～3d后，沿劃線長(zhǎng)出白色克隆.挑取2～3個(gè)克隆，接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250r・min-1震蕩培養(yǎng)16～18h，至A600>1.5.將該菌液按1∶10接種于10mLYPD中，使其A600=0.4～0.6，收菌5mL，室溫離心5000r・min-1,5min,棄上
7、清，以5mL去離子水重懸，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞. 1．2．3以pGBKT7Hsp70轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)取0.1μg“誘餌”質(zhì)粒pGBKT7Hsp70與0.1mg鯡魚精DNA混勻后，加入100μL酵母感受態(tài)，輕混勻后，加入600μLPEG4000/LiAc混和液，劇烈震蕩混勻.30℃震蕩培養(yǎng)30min后，加入70μLDMSO，輕輕顛倒混勻，42℃熱休克15min，冰浴2min,5000g,離心5s后去上清.沉淀用100μLTE
