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《acmnpve18基因酵母雙雜交誘餌載體構建與轉錄自激活檢測》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、AcMNPVel8基因酵母雙雜交誘餌載體構建與轉錄自激活檢測摘要：用PCR方法擴增苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultipienucleopolyhedrovirus,AcMNPV)被膜蛋白0DV-E18基因，克隆至酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7構建誘餌質粒pGBKT7-el8o將誘餌質粒分別轉化酵母菌株Y187和AH109感受態(tài)細胞，被轉化細胞在涂有X-gal的SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上形成白色菌落；在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基上均不形成菌落，表明誘餌基因表達產物BD-E1
2、8在這兩種細胞中都不能激活報告基因轉錄。pGBKT7-el8轉化的Y187細胞在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型液體培養(yǎng)基中的生長速度與空載體轉化細胞相同，顯示BD-E18對酵母細胞無細胞毒性。結果表明，AcMNPV0DV-E18可能不直接參與對宿主細胞或病毒基因表達的調節(jié)，其編碼基因可以作為誘餌基因通過篩查病毒宿主cDNA文庫識別與其相互作用的蛋白質。關鍵詞：苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)；0DV-E18；酵母雙雜交；自激活；細胞毒性中圖分類號:Q785文
3、獻標識碼：A文章編號:0439-8114(2013)10-2436-03苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是a-屬桿狀病毒的代表種，感染30多種鱗翅目昆蟲，是目前研究得最多的桿狀病毒種［1］。AcMNPV在其復制周期中產生兩種結構和功能不同的病毒體：包含體源病毒體(0DV)和芽殖病毒體(BV)oODV和BV分別執(zhí)行病毒在宿主種群個體間的傳遞和受感染蟲體內的系統感染功能［2］。這兩種病毒體包含序列相同的基因組，但蛋白質組成存在差異。目前已經鑒定出40多種A
4、cMNPVODV結構蛋白和相似數目的BV結構蛋白。其中33種結構蛋白共存于0DV和BV病毒體，0DV和BV各有10多種特有蛋白質［3,4］。AcMNPV0DV-E18最初被發(fā)現是一種0DV被膜蛋白［5］。最近的研究報道表明，該蛋白質也存在于BV被膜［4］。el8基因存在于所有已完成測序的桿狀病毒基因組，是桿狀病毒33個核心基因之一。缺el8基因的AcMNPV基因組在被轉染的細胞內不能完成BV復制［6］。其作用機制尚未明了。為了解el8基因在桿狀病毒復制過程中的作用，擬通過酵母雙雜交篩選與ODV-E18相互作用的宿主細胞蛋白。研究克隆了AcMNPVel8基因開
5、放閱讀框，構建了誘餌載體并完成了其在酵母細胞中的自激活和毒性檢測。1材料與方法1.1材料AcMNPV.酵母AH109和Y187菌株、pGBKT7質粒(購自美國Clontech公司)由華中師范大學生命科學學院/遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室保存，SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購自美國Clontech公司，DNA限制性內切酶購自Fermentas(MBI)公司，T4DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司，PfuDNA聚合酶購自北京普博欣生物科技有限責任公司。1.2方法1.2.1el8基因PCR擴增和誘
6、餌載體的構建根據AcMNPV基因組序列［7］設計el8基因開放閱讀框(nt125153-125341)的上游引物el8UP:5'-GGCGAATTCATGTTCTTGACCATCTTG-3'和下游引物el8DN：5'-CTTGCTGCAGTGACCGTTCGAACTTTG-3',以AcMNPVDNA為模板進行PCR擴增。el8UP和el8DN分別對應AcMNPV基因組序列nt125153-125170和nt125376-125394o兩者分別附加EcoRI和PstI限制性內切酶的識別序列。用EcoRI和PstI分別雙酶切el8基因的PCR產物和pGBKT7載
7、體，將回收的酶切載體和PCR片段進行連接反應，構成誘餌載體pGBKT7-el8o1.2.2酵母菌株感受態(tài)細胞的制備及誘餌載體的轉化在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線活化釀酒酵母Y187菌株和AH109菌株，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3?4d；挑取生長狀況良好的單菌落接種于3niL的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C.250r/min振蕩培養(yǎng)8h；從中取4uL的菌液接種到25mLYPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C、250r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14?20h,至0D600nm達到0.15-0.30；離心、棄上清，將細胞沉淀重新懸浮于50mLYPDA液體培養(yǎng)基中，于30
8、°C、250r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3?6h,至0D6
