兩種短命植物hrd轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與抗旱功能驗(yàn)證

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：節(jié)承殍時(shí)間：≯，＼p年占月喀日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存

2、、匯編學(xué)位論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以公布(包括刊登)論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)鬻：黲導(dǎo)師簽名：憂仡衫時(shí)間：力，∞年占月房日時(shí)1日：訓(xùn)夠年6只f3日萬(wàn)方數(shù)據(jù)IIIIIIIIIIIIIIIIIIIY2697885本文是轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)“長(zhǎng)江流域和西北內(nèi)陸棉區(qū)耐旱、耐鹽堿、抗病蟲(chóng)等轉(zhuǎn)基因棉花新品種培育"(項(xiàng)目編號(hào)：2013ZX08005004一009)以及自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項(xiàng)目“線果芥冊(cè)基因的克隆與功能驗(yàn)證”(項(xiàng)目編號(hào)：xj

3、aucxy—yjs-20131018)的部分研究成果課題主持人：陳全家教授(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué))萬(wàn)方數(shù)據(jù)兩種短命植物腳轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與抗旱功能驗(yàn)證摘要干旱和腌漬嚴(yán)重制約著農(nóng)作物的生產(chǎn)和發(fā)展，也是導(dǎo)致地球荒漠化的主要原因，對(duì)世界范圍內(nèi)的作物的生長(zhǎng)帶來(lái)了巨大的影響。新疆是農(nóng)業(yè)大省，農(nóng)業(yè)用水占總用水量的90％以上，而新疆水資源短缺，用于農(nóng)業(yè)的水資源有限，因此利用基因工程手段發(fā)現(xiàn)和分離干旱生境中優(yōu)質(zhì)、高效天然的抗旱相關(guān)基因、研究抗旱機(jī)理以獲得抗旱新品種，無(wú)論對(duì)新疆干旱區(qū)的生態(tài)恢復(fù)，還是對(duì)抗旱作物品種的選育均具有重大的意義。新疆地域遼闊，但是大部都被鹽堿地占據(jù)，正因?yàn)橛?/p>

4、干旱、鹽漬和低溫的非生物脅迫環(huán)境，才孕育出許多適應(yīng)逆境的特色生物資源。線果芥(Conringiaplanisiliqll0L．)和大蒜芥(SisybriumaltissimumL．)就是在新疆大地上世代繁衍而生存下來(lái)的草本綠色植物，屬十字花科類早春短命植物，對(duì)新疆的特殊環(huán)境表現(xiàn)出出色的適應(yīng)性。為了進(jìn)一步研究大蒜芥和線果芥在干旱脅迫下的響應(yīng)機(jī)理，本研究用同源克隆的方法獲得了大蒜芥和線果芥HRD基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草，通過(guò)土壤干旱實(shí)驗(yàn)和PEG．6000模擬干旱實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，結(jié)果證實(shí)了這個(gè)基因?qū)儆卺苁?倔IREBP類轉(zhuǎn)錄因子，具有AP2／E

5、REBP轉(zhuǎn)錄因子的基本特性，在轉(zhuǎn)基因煙草中的過(guò)量表達(dá)可以提高煙草抵抗干旱的能力。主要研究結(jié)果如下：1．分別從新疆短命植物線果芥和大蒜芥中克隆得到了一條完整開(kāi)放閱讀框?yàn)?64bp，編碼187個(gè)氨基酸的HRD轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為cpHea9和SaHRD。比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者僅有3個(gè)位點(diǎn)氨基酸序列的差別，具有很高的同源性，應(yīng)屬于同源物種。與山崳菜(Eutremasalsugineum)、琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)、薺菜(Capsellarubella)及擬南芥(Arabidopsisthaliana)核苷酸序列的同源性可達(dá)88％、87％、87％和86

6、％。2．生物信息學(xué)分析表明：CpHRD和SaHRD基因編碼的蛋白質(zhì)分子量約為20kDa，等電點(diǎn)分別為4．73、4．8l，屬于含信號(hào)肽的親水性非跨膜穩(wěn)定蛋白。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括2個(gè)p一折疊、5個(gè)cc一螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，位于N端有2個(gè)反平行的B．折疊堿性親水區(qū)。二者均只含有一個(gè)保守的AP2／EREBP功能結(jié)構(gòu)域，位于第14—72氨基酸位點(diǎn)之間，據(jù)研究該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆性密切相關(guān)。3．構(gòu)建了CpHRD和SaHRD基因的植物表達(dá)載體，并分別導(dǎo)入到煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因材料。對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了干旱脅迫實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了相關(guān)的生理指標(biāo)，結(jié)果顯示兩種轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱能

7、力均高于對(duì)照組，且轉(zhuǎn)CpHRD基因煙草抗旱性優(yōu)于轉(zhuǎn)勛瑚D基因煙草。4．構(gòu)建了CpHRD和SaHRD原核表達(dá)載體，對(duì)原核表達(dá)體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明在25。C，0．05mmol／LIPTG濃度誘導(dǎo)4h時(shí)蛋白表達(dá)最佳。通過(guò)Westernblotting進(jìn)行鑒定證明表達(dá)的蛋白正是His-HRD融合蛋白。關(guān)鍵詞：短命植物；HRD轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；轉(zhuǎn)基因煙草；抗旱性驗(yàn)證萬(wàn)方數(shù)據(jù)CloningandDroughtFunctionalVerificationofHRDTranscriptionFactorsGenefromTwoKindsofEphemeralAbSt陽(yáng)

8、CtDroughtandpickledrestric