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《蘇云金芽孢桿菌cry5ba3基因的表達(dá)及對(duì)松材線蟲的毒殺效果研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、12ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMastertheExpressionofBacillusThuringiensisCry5Ba3andItsLethalEffectonPineWoodNematodeCandidate:LeiMeng‐yingAdviser:ZhangLi‐qin,ProfessorAssociateSupervisor:WangYong‐jun,AssociateProfessorSpeciality:ForestProtectionDateofSubmission:2015,6,1ZhejiangA&FU
2、niversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaJune,20153摘要松材線蟲?。˙ursaphelenchusxylophilus）是一種毀滅性的松樹病害。cry5Ba3是本實(shí)驗(yàn)室從蘇云金芽孢桿菌zjfc85上克隆獲得的新型毒蛋白基因，其編碼的蛋白對(duì)松材線蟲具有顯著的毒殺活性。為了進(jìn)一步明確cry5Ba3基因編碼的殺蟲晶體蛋白的功能，本研究構(gòu)建了經(jīng)序列優(yōu)化的cry5Ba3基因的表達(dá)質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將cry5Ba3Φ基因整合至灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）的基因組中，通過生測(cè)實(shí)驗(yàn)，明確了轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢對(duì)松材線蟲
3、的毒力。取得以下結(jié)果：1.根據(jù)絲狀真菌密碼子的偏好性，對(duì)cry5Ba3基因進(jìn)行全基因改造。調(diào)整了567個(gè)堿基，使得該基因的密碼子在真菌中獲得最高翻譯效率，改造后的基因命名為cry5Ba3Φ。2.通過體外序列合成的方法，將trpC啟動(dòng)子序列、cry5Ba3基因序列以及trpC終止子序列連接到pUC-57質(zhì)粒上，獲得pUC57-cry5Ba3Φ。通過酶切將其連接到pTFCM質(zhì)粒，獲得根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTFCM-cry5Ba3Φ。3.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含質(zhì)粒pTFCM-cry5Ba3Φ的根癌農(nóng)桿菌AGL-1與灰葡萄孢野生型菌株共培養(yǎng)，在含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選獲得5個(gè)轉(zhuǎn)化子。PCR
4、驗(yàn)證和Southern雜交試驗(yàn)表明cry5Ba3Φ基因單拷貝整合到灰葡萄孢菌基因組中。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明cry5Ba3Φ基因與潮霉素選擇基因一起整合至灰葡萄孢的基因組中，并且穩(wěn)定遺傳。4．qRT-PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因灰葡萄孢菌中cry5Ba3Φ基因的表達(dá)量是house-keeping基因actin的5.6±1.1倍。而cry5Ba3Φ基因在野生型灰葡萄孢菌中沒有表達(dá)。5.生測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用轉(zhuǎn)cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌飼喂松材線蟲，松材線蟲的繁殖總量為對(duì)照的48%-65%，死亡率為對(duì)照的1.7-2.5倍。綜上所述，本研究明確了一個(gè)新的殺蟲晶體蛋白基因cry5Ba3對(duì)松材線蟲的毒殺活性，構(gòu)建了在灰
5、葡萄孢菌中高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因體系，為蘇云金桿菌新型生物農(nóng)藥的開發(fā)及應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌，cry5Ba3基因，灰葡萄孢菌，遺傳轉(zhuǎn)化，松材線蟲4AbstractThepinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus)isadestructivediseaseforpines.Theinsecticidalcrystalproteinencodedbycry5Ba3,previouslyisolatedfromBacillusthuringiensiszjfc85,hasasignificantlylethaleffectonthenemato
6、deB.xylophilus.Todefinethelethaleffectandthemechanismofcry5Ba3onB.xylophilus,codonoptimizationofthisgenewasexecutedtoenhancetheexpressionofcry5Ba3inBotrytiscinerea.TheexpressionvectorpTFCM-cry5Ba3wasconstructed,andtransformedintoBotrytiscinereausingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation(ATM
7、T).TheeffectofCry5Ba3onB.xylophiluswasdetermined.Theresultswaslistedasfollowing.1.Thenewcodinggenewasdesigned(567bpwaschanged)toenhancetheexpressioneffectinfungi,andnamedascry5Ba3Φ,accordingtocodonpre
