DAPK基因啟動子CPG島異常甲基化在膀胱癌中的意義及其機制的研究

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1、復旦大學博士學位論文DAPK基因啟動子CpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義及其機制的研究姓名：胡禮炳申請學位級別：博士專業(yè)：泌尿外科指導教師：王國民20070409論文獨創(chuàng)性聲明本論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均已在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。作者簽名：論文使用授權聲明日期：本人完全了解復旦大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留送交論文的復印件。允許論文被查閱和借閱；學校

2、可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名導師簽名：日期：DAPK基因啟動子CpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義及其機制的研究摘要膀胱移行細胞癌(Transitionalcellcarcinoma,TCO是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。膀胱癌手術后約55％～60％的病例出現(xiàn)復發(fā)，其中16％～25％的腫瘤惡性程度增加【¨。膀胱癌術后復發(fā)和進展一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，其術后的輔助治療和長期隨訪也極大地增加了患者的醫(yī)療費用和痛苦。因此，探索膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制和

3、遺傳學本質，為腫瘤的靶向性治療提供理論基礎，是臨床和科研上急需解決的重要課題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因啟動子區(qū)CpG島(CGI)甲基化能阻礙該基因轉錄，是許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。CGl異常甲基化是表觀遺傳學研究的重要內(nèi)容B3l，DNA甲基化使腫瘤抑癌基因沉默也是Knudson's“兩次打擊論”中除雜合性缺失(LOH)外的重要內(nèi)涵[41。死亡相關蛋白激酶(DeathAssociatedProteinKiaase,DAPK)定位于染色體9q34．1，是一種CaZ’／CaM依賴性的絲／蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)DAPK可通過一系列通

4、路參與誘導凋亡的正向調節(jié)。DAPK在多種腫瘤細胞和組織中出現(xiàn)表達丟失，而且該表達缺失也與其cpo的甲基化改變密切相關阿。本研究在體外細胞水平和臨床標本兩個層面探討DAPK基因cpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義和機制。首先采用RT-PCR和Wcstcm．blot檢測三種不同膀胱癌細胞系(I"24，5637，ScaBER)中DAPK基因的表達狀態(tài)，然后用BSP(b酬fitesequencingPCR)方法分析各細胞中DAPK基因啟動子區(qū)cpG島的甲基化狀態(tài)。分別用甲基轉移酶(DNMT)抑制劑5．a(chǎn)za．deoxycytid／ae和阿霉素

5、處理細胞后用上述方法檢測DAPK的甲基化改變與基因表達的關系。用流式細胞儀檢測不同處理組細胞的凋亡率，分析DAPK基因的表達與細胞凋亡之間的關系。體外轉染DAPK基因至該基因表達缺失的T24細胞中，進一步研究DAPK基因在膀胱癌細胞的生物學功能。在細胞水平的研究基礎上，選擇臨床正常膀胱粘膜上皮和膀胱腫瘤標本用MSP(methylationspecificPCR)方法檢測不同組織標本中DAPK基因唧lG島的甲基化狀態(tài)，同時采用Western．blot和免疫組織化學染色來分析不同組織中DNMTl和DAPK的表達，探討DAPK基因的甲基化

6、改變與腫瘤臨床特點之間的關系和機制。第一部分人膀胱癌細胞中DAPK基因甲基化狀態(tài)的分析人類基因組DNA中的cI'G島處于甲基化壓力和甲基化保護的動態(tài)平衡中。在某些目前尚不明確的因素作用下這種平衡被打破，甲基化逐漸由不影響基因表達周邊區(qū)向決定基因轉錄的核心區(qū)擴散，經(jīng)過一系列復雜的反應，最終使核小體結構變得緊密，阻止轉錄因子的結合，從而使基因表達沉默。DNA甲基化改變使抑癌基因沉默在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有意義，這是目前腫瘤表觀遺傳學研究的重要內(nèi)容．本實驗中，我們選擇三種不同膀胱癌細胞(124，5637，S砷ER)進行體外實驗研究．首先采用半

7、定量RT-PCR和Western．blot分別檢測三種膀胱癌細胞中DAPK基因的表達。免疫熒光技術分析DAPK基因的亞細胞定位。用甲基化特異PCR(MSP)方法檢測三種細胞中的DAPK基因啟動子甲基化狀態(tài)。觀察甲基轉移酶(DMNT)抑制劑5-aza．CdR(5．a(chǎn)za-C：dR)對各細胞中的基因表達和甲基化狀態(tài)的影響。用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，并分析DAPK的表達與膀胱癌細胞凋亡的關系．結果發(fā)現(xiàn)T24細胞中未檢測到DAPK基因的表達，也未檢測到啟動子甲基化：5637細胞中該基因表達水平極低，在ScaBER細胞中該基因的表達較前兩

8、者要高。5637細胞和ScaBER細胞中均有甲基化改變。2．5umol／l濃度的5．a(chǎn)za-CAR作用72h可以有效上調5637和ScaBER細胞的DAPK基因的表達。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR處理細胞后，其DAPK表達上調