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1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文DAPK基因啟動(dòng)子CpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義及其機(jī)制的研究姓名：胡禮炳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：泌尿外科指導(dǎo)教師：王國(guó)民20070409論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對(duì)本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。作者簽名：論文使用授權(quán)聲明日期：本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件。允許論文被查閱和借閱；學(xué)校
2、可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽名導(dǎo)師簽名：日期：DAPK基因啟動(dòng)子CpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義及其機(jī)制的研究摘要膀胱移行細(xì)胞癌(Transitionalcellcarcinoma,TCO是我國(guó)最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。膀胱癌手術(shù)后約55％～60％的病例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中16％～25％的腫瘤惡性程度增加【¨。膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)和進(jìn)展一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，其術(shù)后的輔助治療和長(zhǎng)期隨訪也極大地增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用和痛苦。因此，探索膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制和
3、遺傳學(xué)本質(zhì)，為腫瘤的靶向性治療提供理論基礎(chǔ)，是臨床和科研上急需解決的重要課題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島(CGI)甲基化能阻礙該基因轉(zhuǎn)錄，是許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。CGl異常甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容B3l，DNA甲基化使腫瘤抑癌基因沉默也是Knudson's“兩次打擊論”中除雜合性缺失(LOH)外的重要內(nèi)涵[41。死亡相關(guān)蛋白激酶(DeathAssociatedProteinKiaase,DAPK)定位于染色體9q34．1，是一種CaZ’／CaM依賴性的絲／蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)DAPK可通過一系列通
4、路參與誘導(dǎo)凋亡的正向調(diào)節(jié)。DAPK在多種腫瘤細(xì)胞和組織中出現(xiàn)表達(dá)丟失，而且該表達(dá)缺失也與其cpo的甲基化改變密切相關(guān)阿。本研究在體外細(xì)胞水平和臨床標(biāo)本兩個(gè)層面探討DAPK基因cpG島異常甲基化在膀胱癌中的意義和機(jī)制。首先采用RT-PCR和Wcstcm．blot檢測(cè)三種不同膀胱癌細(xì)胞系(I"24，5637，ScaBER)中DAPK基因的表達(dá)狀態(tài)，然后用BSP(b酬fitesequencingPCR)方法分析各細(xì)胞中DAPK基因啟動(dòng)子區(qū)cpG島的甲基化狀態(tài)。分別用甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑5．a(chǎn)za．deoxycytid／ae和阿霉素
5、處理細(xì)胞后用上述方法檢測(cè)DAPK的甲基化改變與基因表達(dá)的關(guān)系。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的凋亡率，分析DAPK基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。體外轉(zhuǎn)染DAPK基因至該基因表達(dá)缺失的T24細(xì)胞中，進(jìn)一步研究DAPK基因在膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。在細(xì)胞水平的研究基礎(chǔ)上，選擇臨床正常膀胱粘膜上皮和膀胱腫瘤標(biāo)本用MSP(methylationspecificPCR)方法檢測(cè)不同組織標(biāo)本中DAPK基因唧lG島的甲基化狀態(tài)，同時(shí)采用Western．blot和免疫組織化學(xué)染色來分析不同組織中DNMTl和DAPK的表達(dá)，探討DAPK基因的甲基化
6、改變與腫瘤臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系和機(jī)制。第一部分人膀胱癌細(xì)胞中DAPK基因甲基化狀態(tài)的分析人類基因組DNA中的cI'G島處于甲基化壓力和甲基化保護(hù)的動(dòng)態(tài)平衡中。在某些目前尚不明確的因素作用下這種平衡被打破，甲基化逐漸由不影響基因表達(dá)周邊區(qū)向決定基因轉(zhuǎn)錄的核心區(qū)擴(kuò)散，經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)，最終使核小體結(jié)構(gòu)變得緊密，阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而使基因表達(dá)沉默。DNA甲基化改變使抑癌基因沉默在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有意義，這是目前腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容．本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇三種不同膀胱癌細(xì)胞(124，5637，S砷ER)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究．首先采用半
7、定量RT-PCR和Western．blot分別檢測(cè)三種膀胱癌細(xì)胞中DAPK基因的表達(dá)。免疫熒光技術(shù)分析DAPK基因的亞細(xì)胞定位。用甲基化特異PCR(MSP)方法檢測(cè)三種細(xì)胞中的DAPK基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。觀察甲基轉(zhuǎn)移酶(DMNT)抑制劑5-aza．CdR(5．a(chǎn)za-C：dR)對(duì)各細(xì)胞中的基因表達(dá)和甲基化狀態(tài)的影響。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并分析DAPK的表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系．結(jié)果發(fā)現(xiàn)T24細(xì)胞中未檢測(cè)到DAPK基因的表達(dá)，也未檢測(cè)到啟動(dòng)子甲基化：5637細(xì)胞中該基因表達(dá)水平極低，在ScaBER細(xì)胞中該基因的表達(dá)較前兩
8、者要高。5637細(xì)胞和ScaBER細(xì)胞中均有甲基化改變。2．5umol／l濃度的5．a(chǎn)za-CAR作用72h可以有效上調(diào)5637和ScaBER細(xì)胞的DAPK基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR處理細(xì)胞后，其DAPK表達(dá)上調(diào)
