EpCAM基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)關(guān)系研究

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1、中山大學(xué)博七學(xué)位論文中文摘要EpCAM基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)關(guān)系研究TherelationshipofCpGislandmethylationstatusinEpCAMgenepromoterandgeneexpression專業(yè)：人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)博士研究生：于國(guó)龍導(dǎo)師：何蘊(yùn)韶教授中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室中文摘要上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)是細(xì)胞膜表面的一種糖蛋白，是利用單克隆抗體17-1A發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤細(xì)胞表面抗原分子之一，其主要功能是參與細(xì)胞基底膜之間的同源黏附。上皮

2、來源的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)。作為細(xì)胞表面主要抗原，上皮細(xì)胞黏附分子作為免疫治療靶分子引起了廣泛的重視，在臨床上試驗(yàn)研究中，將EpCAM抗體對(duì)結(jié)腸癌腫瘤病人進(jìn)行治療，有效減少術(shù)后的死亡率。在1995年，德國(guó)已經(jīng)允許上皮細(xì)胞黏附分子的抗體應(yīng)用于臨床，治療結(jié)腸癌晚期手術(shù)病人。上皮細(xì)胞黏附分子基因不僅同上皮組織的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且該基因在腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的預(yù)后也密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞黏附分子在上皮來源的多種腫瘤中都出現(xiàn)高表達(dá)，但高表達(dá)原因不清。對(duì)上皮細(xì)胞黏附分子基因上游序列分析發(fā)現(xiàn)，它的啟動(dòng)子沒有一個(gè)典

3、型的啟動(dòng)子所具有的TATA盒。對(duì)該基因啟動(dòng)子功能研究的文獻(xiàn)中，以對(duì)啟動(dòng)子功能和區(qū)域定位研究為主，主要分析上皮細(xì)胞黏附分子基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力、啟動(dòng)子具體的范圍大小。至于該基因在腫瘤中為什么出現(xiàn)高表達(dá)，尚沒有相關(guān)報(bào)道。目前，在對(duì)腫瘤的研究中，引起重視的～個(gè)方面是腫瘤表觀遺傳學(xué)的改變；這種改變主要為DNA修飾和組蛋白的修飾，這種表觀遺傳學(xué)改變并沒中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要有DNA堿基序列的改變，但是卻可以引起基因表達(dá)的改變。表觀遺傳學(xué)的改變引起的基因表達(dá)的改變主要表現(xiàn)在三個(gè)方面：DNA修飾，組蛋白修飾和RNA

4、干擾。目前腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究中以DNA甲基化和去甲基化為研究的熱點(diǎn)之一。在腫瘤的發(fā)生中，出現(xiàn)基因組的整體去甲基化，和部分區(qū)段的高甲基化，這些高甲基化和低甲基化都可以出現(xiàn)在基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化之后，會(huì)出現(xiàn)基因表達(dá)的降低，甚至失表達(dá)，抑制腫瘤發(fā)生的功能降低，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；反之，在一些癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島出現(xiàn)去甲基化后，卻可以誘導(dǎo)基因表達(dá)增高，進(jìn)一步加快腫瘤的發(fā)生發(fā)展。上皮細(xì)胞黏附分子基因，在正常的消化道上皮表達(dá)較低甚至不表達(dá)，但是在上皮出現(xiàn)異常增生和永生化時(shí)

5、，該基因卻出現(xiàn)表達(dá)的異常增高。目前研究表明EpCAM基因?qū)τ谀[瘤的發(fā)生具有促進(jìn)作用，可以上調(diào)c．myc癌基因的表達(dá)。研究表明：抑制上皮細(xì)胞黏附分子基因的表達(dá)可以有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)；對(duì)于結(jié)腸癌的來說，EpCAM分子的抗體，可以有效的治療腫瘤，說明該分子在腫瘤的發(fā)生中有著重要作用。但是該基因在腫瘤中高表達(dá)的機(jī)制仍然不清。該基因的高表達(dá)，是否也存在表觀遺傳學(xué)的改變?在該基因啟動(dòng)子區(qū)是否存在CpG島?該基因的表達(dá)是否有關(guān)?我們首先通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，查找上皮細(xì)胞黏附分子基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp和下游1000bp

6、的基因序列，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析該段基因序列，發(fā)現(xiàn)在該段基因序列中確實(shí)存在著一個(gè)CpG島，并且跨度較長(zhǎng)，但是對(duì)于其在腫瘤中甲基化狀態(tài)研究以及和基因表達(dá)的關(guān)系未見相關(guān)報(bào)道。在本研究中，通過BSP(bisulfitesequencingPCR)技術(shù)，分析在上皮細(xì)胞黏附分子高表達(dá)和不表達(dá)細(xì)胞中該基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，研究CpG島甲基化和該基因表達(dá)的關(guān)系和CpG島的甲基化狀態(tài)，探討上皮細(xì)胞黏附分子在腫瘤中高表達(dá)的機(jī)制，為開發(fā)甲基化分子診斷的試劑盒提供理論依據(jù)。第一章：EpCAM基因概述及啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀

7、態(tài)分析本章主要介紹了EpCAM的一般情況。首先介紹EpCAM基因家族，和EpCAM基因定位。EpCAM的結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞膜上的分布。其次簡(jiǎn)單介紹了EpCAM在不同組織中的表達(dá)情況，以及在胚胎發(fā)育中EpCAM基因的表達(dá)改ll中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要變。EpCAM作為腫瘤預(yù)后因子，和腫瘤分類的分子標(biāo)志的意義。最后我們根據(jù)網(wǎng)絡(luò)資源，查找EpCAM基因啟動(dòng)子區(qū)域的基因序列，然后進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的分析。通過兩個(gè)不同的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對(duì)EpCAM基因的啟動(dòng)子區(qū)域核酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：在EpCAM基因啟動(dòng)子區(qū)域確實(shí)存

8、在著一個(gè)較長(zhǎng)的CpG島，并且該CpG島，橫跨第一外顯子部分，一直延伸到第一內(nèi)含子部分。根據(jù)這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫分析顯示，在EpCAM基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的主要部分互相符合，表明在該段CpG島的甲基化可能同EpCAM基因的表達(dá)具有相關(guān)性。根據(jù)對(duì)EpCAM基因啟動(dòng)子研究的文獻(xiàn)，EpCAM基因啟動(dòng)子主要功能區(qū)在該基因上游．687bp范圍以內(nèi)，我們?cè)诜治鯡pCAM啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的研究范圍時(shí)選擇該基因上游至基因中的-492．