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《抗蟲耐草甘膦多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文抗蟲/耐草甘膦多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的研究姓名：赫福霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：黃大昉20080620摘要玉米是大宗糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，由于蟲害和草害的威脅，導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降?；蚬こ痰恼Q生為玉米蟲害和草害的防治提供了有效手段。G2．epsps基因是從草甘膦長(zhǎng)期污染的極端環(huán)境中分離的熒光假單胞菌(psedomonas／luorescensG2)中克隆的新基因，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。為提高耐草甘膦基因G2一epsps在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)水平，首先對(duì)摹岡進(jìn)行了植物密碼子優(yōu)化，改造后的基岡命名為2raG2．epsps基因，優(yōu)化后基因的e卜c含量由原來(lái)
2、的58％調(diào)整到了53％，與G2．epsps基因核苷酸序列相似性為89％。為使該草甘膦抗性基因編碼產(chǎn)物正確定位于葉綠體，克隆了擬南芥的EPSPS酶的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，大小為244bp，測(cè)序結(jié)果表明該序列與已知序列的相似性為100％。BtcrylAh基因是從我國(guó)自行分離的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)菌株BT8中克隆的新型殺蟲蛋白基因，crylAh基因的編碼產(chǎn)物對(duì)鱗翅目害蟲的殺蟲活性強(qiáng)于目前使用的crylAc或者crylAb基因。crylIe基因是本研究組克隆的另一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的Bt殺蟲基因，其編碼蛋白對(duì)敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。crylIe與c
3、rylAb和crylAc無(wú)交互抗性，將crylAh和crylle構(gòu)建到同一表達(dá)載體中，能夠更為有效地克服現(xiàn)有Bt基因同源性高、種類單一、昆蟲對(duì)Bt蛋白產(chǎn)生抗性等問(wèn)題，同時(shí)可望獲得抗蟲性更好的轉(zhuǎn)基因植物?！け狙芯坷每瓜x基因crylAh和耐草甘膦基因2坍G2一epsps構(gòu)建了雙價(jià)植物表達(dá)載體，通過(guò)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化玉米，以2研G『2．epsps為篩選標(biāo)記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得到了抗性較好的TO代轉(zhuǎn)化植株80株。通過(guò)對(duì)TO、T1、T2代轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)、抗蟲生物活性檢測(cè)、田間草甘膦抗性檢測(cè)表明，共獲得了5個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳具有抗蟲性和草甘膦耐受性的轉(zhuǎn)基因玉米品系。同時(shí)構(gòu)建了含有Btcr
4、ylAh和crylIe基因和耐草甘膦2所G2．epsps基因的三價(jià)植物表達(dá)載體，通過(guò)基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，以2raG2．epsps為篩選標(biāo)記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得To代轉(zhuǎn)化植株69株，PCR檢測(cè)結(jié)果表明：有17株已完整的整合有抗蟲基因crylAh、crylIe和耐草甘膦基因知G2一epsps的3個(gè)目的基因，RT-PCR分析外源基因可以正確轉(zhuǎn)錄，已獲得結(jié)實(shí)轉(zhuǎn)基因植株。三價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的獲得為我國(guó)多基因雙抗性轉(zhuǎn)基因玉米的研究打下了基礎(chǔ)，為下一步的玉米育種提供了材料。實(shí)驗(yàn)中以2朋G2．epsps基因作為篩選標(biāo)記基因，為確定其篩選時(shí)間及篩選壓力，進(jìn)行了玉米愈傷組織對(duì)不同濃度草甘膦
5、的抗性實(shí)驗(yàn)，確定向培養(yǎng)基中添加濃度為lmM的草甘膦異丙胺鹽篩選15天能有效的抑制非轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織的分化，本研究的再生植株的陽(yáng)性率為45％，為玉米及其它單子葉作物轉(zhuǎn)化提供了一種有效、安全的篩選體系。關(guān)鍵詞：抗蟲／耐草甘膦；crylAh基因：crylIe基因；2歷凹一epsps基因；轉(zhuǎn)基因玉米；篩選AbswactResearchontheInsect·-Resistant／Glyphosate—-TolerantMutipleGeneTransformationinMaizeAbstractMaizeisnotonlythestaplef．00dcrop，butalso鋤importantra
6、wmaterialforfeedandindustry,neverthelessthethreatofpe啦andweedsleadstOaseriousdeclineinitsoutputandquality．Thebirthofgeneticengineeringprovidesaneffectiveinca／isforthepreventionandtreatmentofpestsandfeeds．G2-epspsgenewasclonedfromaPsedomonasfluorescensstrednG2isolatedfromanextremelyglyphosatepolluted
7、environment,anditWasanovelgenewhichhasbeenpatented．InordertOimprovetheglyphosate-tOlerant(72一epspsgene’sexpressionlevelintransgenicmaiT豫，thecodonofG2-epspsWaSoptimizedaccordingtotheplant’scodonprefere
