穩(wěn)定表達T7RNAP的BHK_21細胞系的建立

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1、第32卷第6期中國預防獸醫(yī)學報Vol.32,No.62010年6月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineJun.2010穩(wěn)定表達T7RNAP的BHK-21細胞系的建立1,2111112*11*李欣,楊少華,王洪梅,劉曉,武建明,高運東,王立群,仲躋峰,何洪彬(1.山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心,山東濟南250100;2.東北農業(yè)大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱150030)摘要:為建立能穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21細胞系以研究RNA重組

2、疫苗,本研究從BL21(DE3)大腸桿菌中擴增T7RNAP基因,定向克隆于質粒pcDNA3.1(+)中,經雙酶切及測序鑒定,獲得陽性重組質粒pcDNA3.1-T7RNAP。用該質粒轉染BHK-21細胞,經G418篩選14d后獲得陽性細胞株。RT-PCR和westernblot檢測結果表明,建立了穩(wěn)定表達T7RNAP的BHK-21細胞系,并且在不同代次的陽性細胞中能穩(wěn)定表達目的基因和蛋白,該研究為RNA病毒感染性質粒在細胞內轉錄及病毒拯救技術平臺的建立奠定了基礎。關鍵詞:T7RNAP;BHK-21細胞中圖分類

3、號:Q814文獻標識碼:A文章編號:1008-0589(2010)06-0473-03EstablishmentofBHK-21celllinesstablyexpressingT7RNAP1,211111LIXin,YANGShao-hua,WANGHong-mei,LIUXiao,WUJian-ming,GAOYun-dong,2*11*WANGLi-qun,ZHONGJi-feng,HEHong-bin(1.TheResearchCenterofDairyCow,ShandongAcademyofAg

4、ricultralScience,Jinan250100,China;2.CollegeofLifeScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)Abstract:ToestablishthecelllinewithstableexpressionofT7RNApolymerasegene,T7RNAPgenewasamplifiedfromE.coliBL21(DE3)andinsertedintopcDNA3.1(+)vectort

5、oconstructrecombinantplasmidpcDNA-T7RNAP.TheBHK-21celllinestablyexpressingT7RNAPwasgeneratedbypcDNA-T7RNAPtransfectionandthepositivecellcloneswereobtainedaftercontinuallyscreeningusingG418.TheexpressionsofT7RNAPgenewereconfirmedbyRT-PCRandwesternblot.Thece

6、lllinestablyexpressingtheT7RNAPgenecouldprovideaplatformforrescueRNArecombinantvirusinvitroviareversegenetictechnique.Keywords:T7RNAP;BHK-21stablecelllines;reversegenetictechniqueT7RNA聚合酶(T7RNApolymeraseenzyme,本研究利用基因克隆及重組技術,構建了T7T7RNAP)是一種依賴DNA的RNA聚合酶,其編碼

7、RNAP重組pcDNA3.1(+)質粒,轉染BHK-21細胞[1]基因長度為2652bp。該酶是1個單體酶,可特異后,經G418篩選,獲得了具有G418抗性的性識別T7啟動子,在沒有其它蛋白因子的協(xié)助下,BHK-21細胞系;經RT-PCR及WB檢測表明,[2-5]就能介導T7噬菌體晚期基因轉錄的順利進行。G418抗性的BHK-21細胞可穩(wěn)定表達T7RNAPT7RNAP和相應轉錄單元在體內發(fā)生轉錄,以實現mRNA及蛋白。該細胞系為依靠T7RNAP體內轉錄[6-8]病毒的體內拯救。系統(tǒng)建立的RNA病毒反向遺傳技

8、術平臺提供了技*Correspondingauthor收稿日期:2009-10-12基金項目:國家轉基因重大專項(2009ZX08007-006B);山東省自然科學基金(Y2008D20);山東農科院“杰出人才”基金;山東省農業(yè)重大應用技術創(chuàng)新課題;山東省科技攻關項目作者簡介:李欣(1982-),女,黑龍江牡丹江人,碩士研究生,主要從事微生物學研究.*通信作者:E-mail:wangliqun2@163.com;

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