嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究

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1、嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究益生菌食品擁有全球最大的功能性食品市場,嗜酸乳桿菌是目前開發(fā)的益生菌之一。嗜酸乳桿菌菌粉廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。本課題通過對嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究以達(dá)到提高嗜酸乳桿菌菌粉活菌數(shù)、實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)及降低產(chǎn)品成本的目的。論文優(yōu)化了MRS(DeManRogosaandSharpe)培養(yǎng)基，探討了嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)方式，通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑及添加抗冷凍因子制備得到高活菌數(shù)的嗜酸乳桿菌菌粉，探討了菌粉不同條件下的貯藏效果。通過單因素試驗研究了氨基酸

2、、糖類物質(zhì)、還原性物質(zhì)及天然提取物對嗜酸乳桿菌生長的影響。結(jié)果表明谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、胡蘿卜汁、番茄汁及香菇汁能促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長。通過響應(yīng)而優(yōu)化試驗得到改良MRS培養(yǎng)基：蛋白腺10g/L、牛肉膏8g/L、酵母浸粉6g/L、葡萄糖21g/L-22g/L、磷酸氫二鉀3.3g/L、檸檬酸氫二氨2g/L、無水乙酸鈉6g/L-6.25g/L、硫酸鎂2g/L、吐溫-80lml/L及硫酸鎰0?05g/L。優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件為：接種量5%,培養(yǎng)時間18h,培養(yǎng)溫度為37°

3、C,厭氧靜置培養(yǎng)。加堿中和培養(yǎng)方式培養(yǎng)嗜酸乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)5.3X109cfu/mL,與不添加堿組相比提高2倍以上。對嗜酸乳桿菌培養(yǎng)方式研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)可使發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到3.5X1010cfu/mL-3.6X1010cfu/mL。嗜酸乳桿菌代謝物的積累是抑制其生長的首要因素。單因素試驗探討了凍干工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6000r/minXlOmin離心收集菌體，靜置30min,-35°C預(yù)凍24h,-55°C、4-6pa真空度下凍干效果較好。用二水平部分因子設(shè)計、登高設(shè)計及雙因子試驗的方法篩選并優(yōu)化了嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑

4、。得到嗜酸乳桿菌的最佳凍干保護(hù)劑配方為脫脂奶粉100g/L、甘油50n)L/L、海藻糖50g/L、抗壞血酸lg/L、氯化鈉3g/L、明膠lg/L,凍干存活率高達(dá)98%以上，菌粉活菌數(shù)高達(dá)1.2X1011cfu/go將復(fù)合抗冷凍因子添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜酸乳桿菌能夠提高凍干制備菌粉的存活率。同時研究得到2組復(fù)合抗冷凍因子：①甘油4mL/L＞海藻糖4g/L＞氯化鈉4g/L及丙氨酸40mg/L,②肌醇0.1卵、氯化鈉3g/L、牛血清蛋白70mg/L和丙氨酸30mg/Lo通過色澤對比發(fā)現(xiàn)FD1、FD2與FD3（冷凍干燥制備菌粉的方法）

5、制備出的菌粉色澤較為理想。對比掃描電鏡圖片發(fā)現(xiàn)FD1、FD2與FD3在預(yù)凍過程保護(hù)劑介質(zhì)（水）沒有形成較大冰晶，菌體與保護(hù)劑及介質(zhì)（水）在凍結(jié)時沒有發(fā)生分離現(xiàn)象。從受控分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境和人為因素對菌粉質(zhì)量的影響較大，從整體考慮FD1、FD3受控情況優(yōu)于FD2的。通過菌粉及益生菌羊奶粉貯藏試驗發(fā)現(xiàn)低溫貯藏效果較好。FD1、FD2菌粉貯藏情況優(yōu)于FD3的；4°C貯藏吋FD3益生菌羊奶粉貯藏效果最好。研究得到的嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)方法能有效降低凍于制備菌粉的成本，制得菌粉活菌數(shù)可達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，復(fù)合抗冷凍因了應(yīng)用技術(shù)為提高菌體自身

6、抗冷凍能力奠定了技術(shù)支撐。摘要4-6ABSTRACT6-121前言12-211.1嗜酸乳桿菌概述121.2嗜酸乳桿菌培養(yǎng)研究現(xiàn)狀12-141.2.1增菌因子12-131.2.2增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件13-141.3冷凍干燥制備高活菌數(shù)菌粉考慮的因素14-191.3.1菌種內(nèi)在因素（Intrinsicfactors）141.1.2菌齡141.3.3菌懸液菌體的濃度14-151.3.4培養(yǎng)基的成分151.3.5抗逆能力15-171.3.6保護(hù)劑17-181.3.7預(yù)凍18-191.4嗜酸乳桿菌高密度培養(yǎng)及凍干保護(hù)劑的研究現(xiàn)狀191

7、.5目的與意義19-212材料與方法21-301.1材料21-242.1.1菌種212.1.2設(shè)備21-222.1.3試劑22-232.1.4培養(yǎng)基23-242.2技術(shù)路線與試驗方法24-302.2.1技術(shù)路線242.2.2菌種的活化及培養(yǎng)方法242.2.3測定方法24-262.2.2.1發(fā)酵液活菌數(shù)與pH及0D值和酸度的測定242.2.3.2嗜酸乳桿菌生長曲線的測定24-253菌粉及益生菌羊奶粉活菌數(shù)測定25-264菌粉水分的測定方法264增菌因子促進(jìn)嗜酸乳桿菌生長試驗265高密度培養(yǎng)試驗設(shè)計26-271碳源及氮源的篩選2

8、62培養(yǎng)基成分的優(yōu)化26-273增菌因子試驗設(shè)計274細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)276離心收集菌體277冷凍干燥試驗27-281凍干工藝277.2培養(yǎng)時間272.2.7.4靜置時間27-282.2.7.5預(yù)凍溫度的選擇282.2.8復(fù)合保護(hù)劑試驗設(shè)計282.2.9抗冷凍因子篩選方法282.2.10貯藏試