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1、RNA干擾研究進展謝克亮】王世平
2、趙長安2(1新鄉(xiāng)醫(yī)學院本科2001級一部，2新鄉(xiāng)醫(yī)學院牛物化學教研室河南新鄉(xiāng)453003)RNA干擾(RNAinterference,RNAi)現(xiàn)彖是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制，是指內源性或外源性與靶基因的轉錄產物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRXA)在細胞內特界地降解該mRNA,從而致使特界性的基因有效封閉的過程,是一種序列特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilenci
3、ng,PTGS)oRNAi現(xiàn)象已在不同種屬的生物體中發(fā)現(xiàn),下面對RNAi的作用機制、作用特點、生物學意義和應用等的授新研究進展作一綜述。1.RNAi的作用機制與特點1.1RNAi發(fā)生的分子機制RXAi的詳細機制和過程還不十分清楚，目前大致分為以下兒個階段進行：①siRA的形成階段：此階段需要Rde-l,Rde-4和dsRNA特異性的核酸內切酶Dicer等共同參與。Rde-1,4編碼的蛋白識別外源dsRNA,引導dsRNA與Dicer結合,然后,Dicer將dsRNA解旋，再將其裂解為21-25nt大小的小干擾RNA
4、(smallinterferingRNA,siRNA)oDicer定位于胞漿中，但核內mRNA剪切修飾后在向核外運輸過程中也存在RNAi現(xiàn)象，可能有其他類似功能的酶發(fā)揮作用。現(xiàn)認為21-25nt人小并在3,端帶有2-3個堿基懸端且5’端磷酸化的siRNA誘導的RNAi效應最強。Dicer家族在進化上非常保守，有5個組成部分：N-端RNA解旋酶結構域、1個PAZ結構域(Piwi,augonaute,Zwille/pinehead,PAZ)>2個RNase!TT結構域和C端dsRNA結合基序。Dicer在體內一般是以二聚
5、體的形式發(fā)揮作用的，由于不同種族Dicer分子大小不一樣,所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有種族差異⑴。②RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilicencingcomplex,RISC)形成階段：生成的siRNA和RNAi特異性酶如AGO-2、MUT-7、RED-l、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結合形成RISC,具冇序列特界性核酸內切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特界地降解打siRNA同源的靶mRNA。③效應階段汽siRNA引導RISC與同源性的mRNA結合，在ATP及解旋酣(如qde-3,
6、mut-6,mut-14)的作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250kD大小的前體形式變成約lOOkD左右活性形式，同時解旋酶催化同源mRNA與siRXA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5'起始端下游7-10個核廿酸處切斷mRNA,起到特異的抑制基因表達的效果。④擴增階段：該反應以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為摸板，在RNA依賴的RNA聚合0?(RNA-dependentRXApolymerase,RdRP)作用卜，擴增靶mRNA,產生新的二級siRNA,而這些siRN
7、A又能繼續(xù)反作用于靶mRNA。RdRP不僅能增加siRNA的拷貝數(shù)，而且能將異常的單鏈RNA轉變dsRNAoRdRP還是一個重要的“sensor",它能識別正常和異常的RNAo轉基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的識別下啟動RNAi的反應過程⑶。此外，RNAi的擴增效應還町能存在另外兩種機制：①Dicer將長dsRNA切成初級siRNA,這一放人水平取決于dsRNA的長度；②siRNA在酣的作用F可以多次應用，產生進一步的放大效應。1.2RNAi的特點①高度特異性：有時siRNA一個堿基改變就會人大降低封閉靶基因的
8、效果。Brummelkamp"等利用載體表達的小發(fā)夾RNA(smallhairpinRNA,shRNA)來封閉人MCF-7細胞的CDII1基因，shRNA上僅一對堿基的突變就不能抑制CDH1基因的表達。其屮siRNA的中央位置堿基位點和3,末端倒數(shù)笫二個堿基起了格外重耍的作用。②高效率⑴：在細胞內RNAi途徑一旦被卅動，反應信號就被放大。在低等動物中靶基因表達抑制效率大于90%,甚至有人認為每個細胞一份拷貝的dsRA就可以封閉基因的效果。③高成功率：RNAi己被用于線蟲全基因組的功能分析，其屮有50%-80%序列選
9、擇有效，12.9%-27%的基因封閉產生了明顯的片常表型。④種屬時-效性：Irie⑸等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細胞中只能維持一段時間，一般注入dsRXA后的2-3天，RNAi的作川最明顯，爾后1-2犬內，靶mRNA的豐度就能恢復到注射RNAi之前的水平。這町能是由于RNA依賴的核昔脫氨酶脫氨基活性的逐步增高導
