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《實驗八細胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光標記.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、細胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光活體染色實驗原理Mito-TrackerGreen是一種線粒體(mitochondria)綠色熒光探針，可以用于活細胞線粒體特異性熒光染色。Mito-Tracker?Green為采用Molecular?Probes公司的carbocyanine進行了熒光標記的一種Mito-Tracker，分子量為671.88，可以用作線粒體特異性的熒光探針。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen對于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。實驗原理Lyso-TrackerRed是一種溶酶體(lysosome)紅色熒光
2、探針，可以用于活細胞溶酶體特異性熒光染色。Lyso-TrackerRed為采用MolecularProbes公司的DND99進行了熒光標記的帶有弱堿性的熒光探針，可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實現(xiàn)對于溶酶體的特異性熒光標記。中性紅(Neutral?Red)和吖啶橙(AcridineOrange)也都可以對溶酶體進行熒光染色，但中性紅和吖啶橙的染色缺乏特異性。1.實驗目的掌握熒光顯微鏡工作的原理了解細胞器在細胞內(nèi)的分布了解熒光染料的使用方法Lyso-TrackerRed工作液的配制：a.取少量Lyso-TrackerRed按照1:13333-1:20
3、000的比例加入到細胞培養(yǎng)液或適當?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為50-75nM。例如取1μlLyso-TrackerRed加入到20ml或13.33ml細胞培養(yǎng)液或適當?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中。2.溶酶體的熒光標記：a.去除細胞培養(yǎng)液，加入步驟1配制好的并28℃預溫育的Lyso-TrackerRed染色工作液，與細胞28℃共孵育30分鐘。b.去除Lyso-TrackerRed染色工作液，加入500微升預溫的新鮮的細胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。c.取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴PBS，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察d.用熒光顯微鏡或激
4、光共聚焦顯微鏡進行觀察。此時可觀察到溶酶體呈明亮的強熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-TrackerRed染色工作液中Lyso-TrackerRed的濃度或在推薦的時間范圍內(nèi)適當延長染色時間。使用說明：1.Mito-TrackerGreen儲存液的配制：用無水DMSO(anhydrousdimethylsulfoxide)配制Mito-TrackerGreen至終濃度為1mM。配制后可以-20℃或更低溫度避光保存。2.Mito-TrackerGreen工作液的配制：a.取少量1mMMito-TrackerGreen儲存液按照1:5000-1:50
5、000的比例加入到細胞培養(yǎng)液或適當?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為20-200nM。例如取1μlMito-TrackerGreen加入到50ml或5ml細胞培養(yǎng)液或適當?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中?；靹蚝蠹礊镸ito-TrackerGreen工作液。HBSSwithCa2+&Mg2+(C0219)可以向碧云天訂購。b.Mito-TrackerGreen工作液使用前需28℃預溫育。注：工作液中Mito-TrackerGreen的濃度可以根據(jù)實際情況進行適當調(diào)整。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Mito-T
6、rackerGreen。3.線粒體的熒光標記：a.去除細胞培養(yǎng)液，加入步驟2配制好的并28℃預溫育的Mito-TrackerGreen染色工作液，與細胞28℃共孵育15-45分鐘。b.去除Mito-TrackerGreen染色工作液，加入500微升28℃預溫育的新鮮細胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。c.取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴PBS，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察。d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行觀察。此時可觀察到線粒體呈明亮的強熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-TrackerGreen染色工作液中Mito-TrackerGreen的濃度或在推
7、薦的時間范圍內(nèi)適當延長染色時間。1打開可將光和激發(fā)光光源（預熱10分鐘）2遮光板遮住激發(fā)光3選擇“1”，在可見光下，聚焦，觀察清晰圖像，再調(diào)到高倍鏡下，微調(diào)至清晰4關(guān)掉可見光光源，打開遮光板，讓激發(fā)光透過5選擇“G”觀察紅色熒光6選擇“B”觀察綠色熒光
