實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光標(biāo)記.ppt

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1、細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光活體染色實(shí)驗(yàn)原理Mito-TrackerGreen是一種線粒體(mitochondria)綠色熒光探針，可以用于活細(xì)胞線粒體特異性熒光染色。Mito-Tracker?Green為采用Molecular?Probes公司的carbocyanine進(jìn)行了熒光標(biāo)記的一種Mito-Tracker，分子量為671.88，可以用作線粒體特異性的熒光探針。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen對(duì)于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)原理Lyso-TrackerRed是一種溶酶體(lysosome)紅色熒光

2、探針，可以用于活細(xì)胞溶酶體特異性熒光染色。Lyso-TrackerRed為采用MolecularProbes公司的DND99進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的熒光探針，可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于溶酶體的特異性熒光標(biāo)記。中性紅(Neutral?Red)和吖啶橙(AcridineOrange)也都可以對(duì)溶酶體進(jìn)行熒光染色，但中性紅和吖啶橙的染色缺乏特異性。1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢晒怙@微鏡工作的原理了解細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的分布了解熒光染料的使用方法Lyso-TrackerRed工作液的配制：a.取少量Lyso-TrackerRed按照1:13333-1:20

3、000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為50-75nM。例如取1μlLyso-TrackerRed加入到20ml或13.33ml細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中。2.溶酶體的熒光標(biāo)記：a.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟1配制好的并28℃預(yù)溫育的Lyso-TrackerRed染色工作液，與細(xì)胞28℃共孵育30分鐘。b.去除Lyso-TrackerRed染色工作液，加入500微升預(yù)溫的新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。c.取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴PBS，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察d.用熒光顯微鏡或激

4、光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到溶酶體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-TrackerRed染色工作液中Lyso-TrackerRed的濃度或在推薦的時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。使用說明：1.Mito-TrackerGreen儲(chǔ)存液的配制：用無水DMSO(anhydrousdimethylsulfoxide)配制Mito-TrackerGreen至終濃度為1mM。配制后可以-20℃或更低溫度避光保存。2.Mito-TrackerGreen工作液的配制：a.取少量1mMMito-TrackerGreen儲(chǔ)存液按照1:5000-1:50

5、000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為20-200nM。例如取1μlMito-TrackerGreen加入到50ml或5ml細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中。混勻后即為Mito-TrackerGreen工作液。HBSSwithCa2+&Mg2+(C0219)可以向碧云天訂購。b.Mito-TrackerGreen工作液使用前需28℃預(yù)溫育。注：工作液中Mito-TrackerGreen的濃度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Mito-T

6、rackerGreen。3.線粒體的熒光標(biāo)記：a.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟2配制好的并28℃預(yù)溫育的Mito-TrackerGreen染色工作液，與細(xì)胞28℃共孵育15-45分鐘。b.去除Mito-TrackerGreen染色工作液，加入500微升28℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。c.取出蓋玻片，在載玻片上滴一滴PBS，將蓋玻片反扣在載玻片上，熒光觀察。d.用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到線粒體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高M(jìn)ito-TrackerGreen染色工作液中Mito-TrackerGreen的濃度或在推

7、薦的時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。1打開可將光和激發(fā)光光源（預(yù)熱10分鐘）2遮光板遮住激發(fā)光3選擇“1”，在可見光下，聚焦，觀察清晰圖像，再調(diào)到高倍鏡下，微調(diào)至清晰4關(guān)掉可見光光源，打開遮光板，讓激發(fā)光透過5選擇“G”觀察紅色熒光6選擇“B”觀察綠色熒光