丙種球蛋白的制備.ppt

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1、丙種球蛋白的電泳制備—預(yù)習(xí)方案組別：第二組成員：張婉月臧贏徐潔嚴夢迎陳孝顏指導(dǎo)老師：韋平和彭佳平丙種球蛋白概念中文簡稱：“丙球”英文名稱：γ-globulin、gammaglobulin別名：免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）丙種球蛋白預(yù)防傳染性肝炎，預(yù)防麻疹等病毒性疾病感染，治療先天性丙種球蛋白缺乏癥，與抗生素合并使用，可提高對某些嚴重細菌性和病毒性疾病感染的療效。注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白（γ-球蛋白），有時丙種球蛋白也被混稱為“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。（2）藥理作用注射丙種

2、球蛋白是一種被動免疫療法。它是把免疫球蛋白內(nèi)含有的大量抗體輸給受者，使之從低或無免疫狀態(tài)很快達到暫時免疫保護狀態(tài)。由于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死細菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對預(yù)防細菌、病毒性感染有一定的作用。（3）適應(yīng)癥丙種球蛋白是血液中一種蛋白質(zhì)，它通常來源于許多人獻的血液，常被用來防止和治療感染，對慢性疲勞癥有顯著的改善作用。適用于預(yù)防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治療先生性丙種球蛋白缺乏癥，可提高對某些嚴重細菌性和病毒性疾病感染的療效。制備丙種球蛋白的方法丙種球蛋白的兩種分離制備的方法①層析法（如：SephadexG-50）定義:是一種利用混合物中

3、諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。②電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳)定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場中以不同的遷移速度向電極移動，而達到分離目的的分析方法。SEPHADEXG-50Sephadex是由葡聚糖通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒。Sephadex凝膠按交聯(lián)度不同，用SephadexG加一個數(shù)字來區(qū)別型號,數(shù)字越小,表示介質(zhì)交聯(lián)度,分級范圍越小，反之亦然。電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙

4、烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。垂直平板：1多個樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致－－便于利用各種鑒定方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠2可以進行雙向電泳3電泳時熱量容易消散，凝膠結(jié)果便于照相和易于制成干膠圓盤電泳：1、缺點是由于聚合效應(yīng)，凝膠的長度和直徑有細微差別，即使同一樣品在兩個凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也會不同2、但是研究工作中還會用到圓盤電泳，例如測定放射性標(biāo)記的樣品測定蛋白質(zhì)的生物活性；測定蛋白質(zhì)分離的最適pH，凝膠濃度；雙向電泳中第一相的分離。聚丙烯酰胺

5、凝膠有下列特性：凝膠透明，有彈性，機械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；對pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用；樣品用量少，靈敏度可達10-6g;凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；分辨率高。凝膠系統(tǒng)的分類1、連續(xù)性凝膠電泳連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)。2、不連續(xù)凝膠電泳垂直電泳原理陰極電泳用水溶性樹脂是一種陽離子型化合物，用有機酸中和，在水中溶解后，以分子和離子平衡狀態(tài)存在于直流電場中

6、，兩極產(chǎn)生電位差，離子發(fā)生定向移動，陽離子向陰極移動，并在陰極表面上得到電子沉積于陰極表面，而陰離子向陽極移動，在陽極上放出電子氧化成酸。這就是電泳涂裝的基本原理。它是一個非常復(fù)雜的電化學(xué)反應(yīng)，其中包括：電解、電泳、電沉積、電滲四個同時進行的過程。實驗步驟（1）溶液的配制a)a貯液為49.5%T,3%Cb)b貯液為49.5%T,6%C。c)膠緩沖液為3molTrisd)0.3g/LSDS用HCl調(diào)pH值至8145e)陽極緩沖液為0.2molTrisf)用HCl調(diào)pH值至8.9。g)陰極緩沖液為0.1molTrish)0.1molTricinei)0.13g/LSDS用HCl調(diào)

7、pH值至8125。j)樣品緩沖液為3molTris(pH8.45)k)0.8gSDSl)0.3molDTTm)少許溴酚藍,定容至10ml。n)膠的制備:按文獻分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠,依次灌膠。(2)樣品處理去除血清白蛋白后的樣品與2倍體積U9緩沖液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)混勻,400～600r/min冰浴振蕩30min變性。取變性后樣品與樣品緩沖液等體積混勻,60℃水浴加熱5min。(3)電泳內(nèi)槽裝陰極緩沖液,外槽用陽極緩沖液恒壓電泳,先40V約1.5h,當(dāng)樣品進入分離膠