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1、丙種球蛋白的電泳制備—預(yù)習(xí)方案組別：第二組成員：張婉月臧贏徐潔嚴(yán)夢(mèng)迎陳孝顏指導(dǎo)老師：韋平和彭佳平丙種球蛋白概念中文簡(jiǎn)稱：“丙球”英文名稱：γ-globulin、gammaglobulin別名：免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）丙種球蛋白預(yù)防傳染性肝炎，預(yù)防麻疹等病毒性疾病感染，治療先天性丙種球蛋白缺乏癥，與抗生素合并使用，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒性疾病感染的療效。注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白（γ-球蛋白），有時(shí)丙種球蛋白也被混稱為“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。（2）藥理作用注射丙種
2、球蛋白是一種被動(dòng)免疫療法。它是把免疫球蛋白內(nèi)含有的大量抗體輸給受者，使之從低或無(wú)免疫狀態(tài)很快達(dá)到暫時(shí)免疫保護(hù)狀態(tài)。由于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死細(xì)菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對(duì)預(yù)防細(xì)菌、病毒性感染有一定的作用。（3）適應(yīng)癥丙種球蛋白是血液中一種蛋白質(zhì)，它通常來(lái)源于許多人獻(xiàn)的血液，常被用來(lái)防止和治療感染，對(duì)慢性疲勞癥有顯著的改善作用。適用于預(yù)防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治療先生性丙種球蛋白缺乏癥，可提高對(duì)某些嚴(yán)重細(xì)菌性和病毒性疾病感染的療效。制備丙種球蛋白的方法丙種球蛋白的兩種分離制備的方法①層析法（如：SephadexG-50）定義:是一種利用混合物中
3、諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。②電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳)定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽(yáng)離子或陰離子，在外加電場(chǎng)中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)，而達(dá)到分離目的的分析方法。SEPHADEXG-50Sephadex是由葡聚糖通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒。Sephadex凝膠按交聯(lián)度不同，用SephadexG加一個(gè)數(shù)字來(lái)區(qū)別型號(hào),數(shù)字越小,表示介質(zhì)交聯(lián)度,分級(jí)范圍越小，反之亦然。電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙
4、烯酰胺凝膠，在電泳的過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。垂直平板：1多個(gè)樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致－－便于利用各種鑒定方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠2可以進(jìn)行雙向電泳3電泳時(shí)熱量容易消散，凝膠結(jié)果便于照相和易于制成干膠圓盤電泳：1、缺點(diǎn)是由于聚合效應(yīng)，凝膠的長(zhǎng)度和直徑有細(xì)微差別，即使同一樣品在兩個(gè)凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也會(huì)不同2、但是研究工作中還會(huì)用到圓盤電泳，例如測(cè)定放射性標(biāo)記的樣品測(cè)定蛋白質(zhì)的生物活性；測(cè)定蛋白質(zhì)分離的最適pH，凝膠濃度；雙向電泳中第一相的分離。聚丙烯酰胺
5、凝膠有下列特性：凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無(wú)吸附和電滲作用；樣品用量少，靈敏度可達(dá)10-6g;凝膠孔徑可調(diào)節(jié)；分辨率高。凝膠系統(tǒng)的分類1、連續(xù)性凝膠電泳連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)。2、不連續(xù)凝膠電泳垂直電泳原理陰極電泳用水溶性樹脂是一種陽(yáng)離子型化合物，用有機(jī)酸中和，在水中溶解后，以分子和離子平衡狀態(tài)存在于直流電場(chǎng)中
6、，兩極產(chǎn)生電位差，離子發(fā)生定向移動(dòng)，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，并在陰極表面上得到電子沉積于陰極表面，而陰離子向陽(yáng)極移動(dòng)，在陽(yáng)極上放出電子氧化成酸。這就是電泳涂裝的基本原理。它是一個(gè)非常復(fù)雜的電化學(xué)反應(yīng)，其中包括：電解、電泳、電沉積、電滲四個(gè)同時(shí)進(jìn)行的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)步驟（1）溶液的配制a)a貯液為49.5%T,3%Cb)b貯液為49.5%T,6%C。c)膠緩沖液為3molTrisd)0.3g/LSDS用HCl調(diào)pH值至8145e)陽(yáng)極緩沖液為0.2molTrisf)用HCl調(diào)pH值至8.9。g)陰極緩沖液為0.1molTrish)0.1molTricinei)0.13g/LSDS用HCl調(diào)
7、pH值至8125。j)樣品緩沖液為3molTris(pH8.45)k)0.8gSDSl)0.3molDTTm)少許溴酚藍(lán),定容至10ml。n)膠的制備:按文獻(xiàn)分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠,依次灌膠。(2)樣品處理去除血清白蛋白后的樣品與2倍體積U9緩沖液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)混勻,400～600r/min冰浴振蕩30min變性。取變性后樣品與樣品緩沖液等體積混勻,60℃水浴加熱5min。(3)電泳內(nèi)槽裝陰極緩沖液,外槽用陽(yáng)極緩沖液恒壓電泳,先40V約1.5h,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠
