細(xì)菌種屬的分子鑒定(課件).doc

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1、用16SrDNA方法鑒定細(xì)菌種屬—、目的1.掌握16SrDNA對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的原理及方法；2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段冋收等實(shí)驗(yàn)操作。二、原理隨著分了生物學(xué)的迅速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進(jìn)入到備種基因型分類水平，如(G+C)mol%、DNA雜交、rDNA扌旨紋圖、質(zhì)粒圖譜和16SrDNA序列分析等。細(xì)菌屮包括有三種核糖體RNA,分別為5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。16SrRNA對(duì)應(yīng)于基因組DNA上的一段基因序列稱為16SrDNA。5SrRNA雖易分析，但核甘酸太少，沒有足夠的遺傳信息用于分類研

2、究；23SrRNA含有的核廿酸數(shù)幾乎是16SrRNA的兩倍，分析較困難。而16SrRNA相對(duì)分子量適屮，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，因此,現(xiàn)在一般普遍采用16SrRNA作為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn)行測序分析。利用16SrDNA鑒定細(xì)菌的技術(shù)路線：三、操作步驟(-)細(xì)菌基因組DNA提左1.挑單菌落接種到10mLLB培養(yǎng)基屮37°C振蕩過夜培養(yǎng)。2.取2mL培養(yǎng)液到2mLEppendorf管屮，8000rpm離心2分鐘示倒掉上清液。3.加140J1LTE打散細(xì)菌，再加入60

3、1L10mg/ml的溶菌酶。37°C放置10分鐘。4.加入40

4、0gLDigestionBuffer,混勻。再加入3piLProteinK,混勻，55°C溫育5分鐘。5.加入260

5、1L乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱屮。10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。1.加入500

6、1L70%乙醇(WashSolution),10000rpm離心0.5分鐘。2.重復(fù)第六步。&再10000rpm離心2分鐘徹底甩干乙醉。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管。9.加入50yL預(yù)熱（60°C）的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000rpm離心2分鐘，流下的液體即為基因組DNAo10.電泳。取3

7、iL溶液電泳檢測質(zhì)量。（二）PCR擴(kuò)增1.根據(jù)已發(fā)表

8、的16SrDNA序列設(shè)計(jì)保守的擴(kuò)增引物。16S（F）5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,16S（R）5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,2.PCR擴(kuò)增體系：在0.2mLEppendorf管屮加入lpLDNA,再加入以「卜反應(yīng)混合液:16S(F)l

9、iL(10gM)16S(R)lOxPCRBufferl

10、iL(10pM)5gLdNTP4

11、iLTaq酶0.5pL加ddH2O使反應(yīng)體系調(diào)至50pL,簡單離心混勻。3.PCR反應(yīng)將Eppendorf管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴(kuò)增條件。擴(kuò)增條件為:94°C3min94°C30secj50°C45secr35cy

12、cles72°C100sec72°C7min4.PCR產(chǎn)物的電泳檢測拿出Eppendorf管，從屮取出5pL反應(yīng)產(chǎn)物，加入lyL上樣緩沖液，混勻。點(diǎn)入預(yù)先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中。電泳lhr。在紫外燈下檢測擴(kuò)增結(jié)果。（三）擴(kuò)增片段的回收根據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為唯一條帶，可直接冋收產(chǎn)物。否則從瓊脂糖凝膠屮切割核酸條帶，并冋收目的片段。1）稱量一2mL.的Eppendorf管質(zhì)量，記錄。2）在紫外燈下切割含日的條帶的凝膠，放入2mL的Eppendorf管內(nèi)，稱量。計(jì)算凝膠質(zhì)量。3）每100mg凝膠加入100gLBindingBuffer,混勻。60°C溫療至凝膠融化4）全部轉(zhuǎn)入

13、UNIQ-10柱屮。10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。5）加入500pLBindingBuffer,10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。6）加入70%乙醇（WashSolution）,10000rpm離心0.5分鐘。7）再10000rpm離心2分鐘徹底甩干乙醉。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml的離心管。8）加入30pL預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000rpm離心2分鐘，流下的液體即為冋收的DNA片段。）DNA片段測序?qū)帐盏钠嗡椭辽锕緶y序，測序引物為16SPCR引物。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.根據(jù)測序結(jié)果，到NCBI上進(jìn)行比對(duì)，確定該未知菌的種屬。

14、2.根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制。寫明所用軟件及大致的分析方法。3.分析討論實(shí)驗(yàn)的過程及結(jié)果。