淺析PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用.pdf

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1、應(yīng)用技術(shù)●I淺析PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用田雪冬(淄博市食品藥品檢驗(yàn)所255000)[摘要]食品行業(yè)屬于環(huán)環(huán)相扣的生產(chǎn)、運(yùn)營過程，食品不可避免在生產(chǎn)、流轉(zhuǎn)及銷售等環(huán)節(jié)受到各類微生物的污染，影響品質(zhì)，因此我國實(shí)行微生物檢測是監(jiān)督食品安全的重要手段。PCR技術(shù)憑借其操作便捷、檢測快捷及準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢，為我國食品行業(yè)的發(fā)展及國民身體健康奠定保障。因此，PCR技術(shù)的應(yīng)用不僅利于民生基礎(chǔ)設(shè)施，且利于我國與國際間的貿(mào)易發(fā)展，具有重要意義[關(guān)鍵詞]PCR技術(shù)，食品檢驗(yàn)；聚合酶，DNA中圖分類號：TS207文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文

2、章編號：1009-914X(2014)27—0385-011．常規(guī)PCR檢溯2．4巢式PCR常規(guī)PCR檢測原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、適當(dāng)緩沖液和MgCl2巢式PCR(nestingPCR)是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR技術(shù)，用內(nèi)溶液的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對一對寡核苷酸引物所外兩對引物先后擴(kuò)增靶基因片段。通常是先用第一套引物擴(kuò)增15"30+循環(huán)，再界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過模板DNA、引物之間的變性、退火用已擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增l53O個(gè)

3、循環(huán)。(復(fù)性)、延伸等三步反應(yīng)為一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目標(biāo)DNA片段得以擴(kuò)增。其2．5免疫一PCR三個(gè)基本反應(yīng)步驟為：(1)模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93~C左右一定時(shí)免疫-PCR由Sano等首創(chuàng)，是指用DNA分子作為標(biāo)記物，在做一般的免疫間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳分析的免疫試驗(yàn)。在免疫一PCR中，多用生物便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備，(2)模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板素作為連接分子。生物素具有兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，

4、一個(gè)可與DNA分子結(jié)合，DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55~C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序另一個(gè)能與抗原2抗體復(fù)合物上的親和素結(jié)合，由此將DNA分子和抗原一抗體列配對結(jié)合；(3)引物的延伸DNA模板——一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶復(fù)合物專一性地連接在一起，形成抗原一抗體一親和素一生物素一DNA復(fù)合物，的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，然后加入PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，標(biāo)記的DNA便可。合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。這就完成了一個(gè)PCR循環(huán)，2．6熒光

5、定量PCR新合成的鏈都可作為下一次反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量是以指數(shù)級方式增實(shí)時(shí)熒光定量PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)(FIET)應(yīng)用于常規(guī)多聚酶鏈?zhǔn)郊?。反?yīng)儀中，通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極一偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移2．多■PCR到受體發(fā)色團(tuán)，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測多重PCR是PCR技術(shù)的一種，是指在同一反應(yīng)體系中加入兩對或兩對以PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度，從而達(dá)到定量目的。上引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因或DNA序列。首先將雙鏈DNA熱變性成單鏈2，7熱起動(dòng)

6、PCRDNA，然后，人工合成的引物與單鏈DNA靶序列結(jié)合，在4種堿基dNTPs底物熱起動(dòng)PCR指的是使TaqDNA聚合酶只在樣品溫度超過至少70"C時(shí)才發(fā)存在下，在DNA聚合酶作用下，引物沿著DNA單鏈從5末端到3末端方向延揮作用的PCR。熱起動(dòng)可減少非靶序列的擴(kuò)增，從而提高反應(yīng)的特異性。熱起動(dòng)伸，合成新的雙鏈。新合成的雙鏈又作為模板，重復(fù)上面的聚合酶反應(yīng)，合成新的基本方法是在進(jìn)行PCR反應(yīng)之初，將TaqDNA聚合酶、氯化鎂和引物這些的DNA雙鏈，經(jīng)過20～35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增出大量拷貝。DNA合成所必需的關(guān)鍵性試

7、劑先不要加入樣品管內(nèi)，而將樣品管加熱，待溫度2．1多重PCR的特點(diǎn)上升至70"(2以上時(shí)。再將上述試劑加入，開始PCR反應(yīng)。高效性；系統(tǒng)性；經(jīng)濟(jì)簡便性。3．結(jié)柬語22多重PCR在食品微生物檢測中應(yīng)用食品安全受到人們的廣泛關(guān)注。食品在生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)都會(I)多重PCR在食品病原微生物檢測中的應(yīng)用。食品污染的病原菌主要包受到微生物得感染，對微生物的檢測是食品安全檢測中的一個(gè)中要組成部分，括腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌、彎曲菌、單核細(xì)胞增PCR技術(shù)的廣泛使用可以很好的對微生物進(jìn)行

8、檢測，解決人們的食品安全問生李斯特菌、副溶血性弧菌、耐藥球菌等，在檢測這些微生物過程中，很容易受題。而PCR技術(shù)也隨著近幾年技術(shù)的不斷進(jìn)步，不斷進(jìn)行了改進(jìn)，PCR技術(shù)都到其它微生物和本身變異株的干擾，造成假陽性和準(zhǔn)確率不高的現(xiàn)象。目前，越在食品檢驗(yàn)中發(fā)揮了重要作用。來越多的研究使用多重PCR檢測這些病原菌。(2)多重PCR~E食品非致病菌檢參考文獻(xiàn)測中的應(yīng)用。乳酸菌(LAB)是真空環(huán)境下的主要微生物