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《細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、BD流式系列課堂-1：研究細(xì)胞生命活動(dòng)的流式解決方案細(xì)胞凋亡概述?又稱為程序性細(xì)胞死亡(ProgrammedCellDeath)是機(jī)體主動(dòng)的、高度有序地清除無用細(xì)胞的過程。和細(xì)胞壞死(Necrosis)相區(qū)別，壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。薄膜有小泡狀形成細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系3細(xì)胞凋亡事件發(fā)生表細(xì)胞膜事件線粒體事件Caspase事件細(xì)胞核事件1.細(xì)胞膜變化的檢測(cè)：AnnexinV/PI磷脂酰絲氨酸(PS)的檢測(cè)：早期凋亡早期凋亡PS檢測(cè)及結(jié)果判定早期凋亡特征：?磷脂膜(PS)外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性?DNA沒有發(fā)
2、生斷裂早期凋亡PS檢測(cè)及結(jié)果判定PIAnnexinV-FITC細(xì)胞膜變化的檢測(cè)：AnnexinV/PI優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞樣本設(shè)置：1.空白對(duì)照：輔助判斷管，即不加AnnexinV/PI，但用它調(diào)電壓的話，電壓偏高，即根據(jù)它確定的陰陽性界限是偏低的。2.陰性對(duì)照：未誘導(dǎo)的，AnnexinV/PI雙染，細(xì)胞絕大部分都在雙陰性區(qū)域，用它來確定兩熒光通道的電壓，這是為了排除非特異性結(jié)合。3.單陽樣本：誘導(dǎo)凋亡，AnnexinV單染，用來調(diào)補(bǔ)償4.單陽樣本：誘導(dǎo)凋亡，PI單染，用來調(diào)補(bǔ)償注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞制備或儲(chǔ)存時(shí)細(xì)胞膜損傷，造成假陽性2.貼
3、壁細(xì)胞消化時(shí)避免使用EDTA，螯合鈣離子BDAnnexinV流式檢測(cè)試劑盒KitCatno.AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitI556547AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKit556570II-Containsunlabeledrecomb.AnnexinVAnnexinV:PEApoptosisDetectionKitI559763提供FITC,PE,APC,CY5,CY5.5,BDHorizonV450,BDHorizonV500等多種熒光標(biāo)記的AnnexinV以及純凈的AnnexinV。Annex
4、inV檢測(cè)常見問題1.是否AnnexinVKits可以檢測(cè)小鼠或其他物種??AnnexinV試劑盒可以檢測(cè)多種屬2.這個(gè)試劑盒是否可用于貼壁細(xì)胞、固定或凍存的細(xì)胞、或組織??No.上述樣本的細(xì)胞細(xì)胞膜都會(huì)或多或少受到損害，這樣的樣本建議用免疫熒光技術(shù)(Cat.No.550911)3.是否與細(xì)胞表面標(biāo)記兼容?CD11B/MAC-1LY-71?只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時(shí)做2.線粒體水平的檢測(cè)激活Caspase9—激活Caspase3—啟動(dòng)細(xì)胞凋亡2.線粒體水平的檢測(cè)?凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān)?BDMitoscreen(JC-1)Cat#55130
5、225tests?JC-1:可穿透細(xì)胞膜的親脂性陽離子熒光素?原理：JC-1在正常細(xì)胞中以聚合體形式存在于線粒體基質(zhì)上產(chǎn)生紅色熒光（FL-2Channel）；細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生去極化，膜電位降低，JC-1以單體形式存在于胞漿內(nèi)，熒光強(qiáng)度減弱甚至消失，故用熒光信號(hào)的變化判別凋亡的發(fā)生。p操作簡(jiǎn)單，試劑直接加入細(xì)胞中，20分鐘后檢測(cè)JC-1檢測(cè)結(jié)果流式圖JurkatTCellsMouseThymocytesControlControlR1R1R1R2R2R2StaurosporineCamptothecinFasmAbJCR1R1R1-1(Fl-2)R2R2R2
6、JC-1(Fl-1)3.凋亡相關(guān)酶的檢測(cè)-Caspase?背景知識(shí)–細(xì)胞凋亡過程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）–Caspase3是參與DNA維護(hù)和調(diào)控細(xì)胞的重要組分，即Caspase3激活==細(xì)胞凋亡–檢測(cè)原理：是通過特異性抗體檢測(cè)全長(zhǎng)或者剪切后的Caspase活性。Caspase-3data（IHC）JurkatT-Cells6μMcamptothecinfor4huntreatedCaspase-3data（FCM）JurkatT-CellsMouseThymocytesCaspase-3KitsFIT
7、CActiveCaspase-3CatNo.ApoptosisKitFITCActiveCaspase-3550480ApoptosisKitPEActiveCaspase-3550914ApoptosisKitPARPcleaved–Caspase3水解產(chǎn)物?PARPs：一類由DNA鏈斷裂而被激活的DNA修復(fù)酶。PARP可以被Caspase-3水解成兩個(gè)大小分別為24-和89-kDa的片段而失活?PARPcleaved是凋亡細(xì)胞中活化的Caspase-3水解產(chǎn)物，代表Caspase酶失去活性?細(xì)胞凋亡的標(biāo)志PARPcleaved–Caspase3水
