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1、BD流式系列課堂-1：研究細胞生命活動的流式解決方案細胞凋亡概述?又稱為程序性細胞死亡(ProgrammedCellDeath)是機體主動的、高度有序地清除無用細胞的過程。和細胞壞死(Necrosis)相區(qū)別，壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。薄膜有小泡狀形成細胞凋亡與疾病的關(guān)系3細胞凋亡事件發(fā)生表細胞膜事件線粒體事件Caspase事件細胞核事件1.細胞膜變化的檢測：AnnexinV/PI磷脂酰絲氨酸(PS)的檢測：早期凋亡早期凋亡PS檢測及結(jié)果判定早期凋亡特征：?磷脂膜(PS)外翻，但是細胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性?DNA沒有發(fā)
2、生斷裂早期凋亡PS檢測及結(jié)果判定PIAnnexinV-FITC細胞膜變化的檢測：AnnexinV/PI優(yōu)點：簡便、快速、準確區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞樣本設(shè)置：1.空白對照：輔助判斷管，即不加AnnexinV/PI，但用它調(diào)電壓的話，電壓偏高，即根據(jù)它確定的陰陽性界限是偏低的。2.陰性對照：未誘導的，AnnexinV/PI雙染，細胞絕大部分都在雙陰性區(qū)域，用它來確定兩熒光通道的電壓，這是為了排除非特異性結(jié)合。3.單陽樣本：誘導凋亡，AnnexinV單染，用來調(diào)補償4.單陽樣本：誘導凋亡，PI單染，用來調(diào)補償注意事項：1.細胞制備或儲存時細胞膜損傷，造成假陽性2.貼
3、壁細胞消化時避免使用EDTA，螯合鈣離子BDAnnexinV流式檢測試劑盒KitCatno.AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKitI556547AnnexinV:FITCApoptosisDetectionKit556570II-Containsunlabeledrecomb.AnnexinVAnnexinV:PEApoptosisDetectionKitI559763提供FITC,PE,APC,CY5,CY5.5,BDHorizonV450,BDHorizonV500等多種熒光標記的AnnexinV以及純凈的AnnexinV。Annex
4、inV檢測常見問題1.是否AnnexinVKits可以檢測小鼠或其他物種??AnnexinV試劑盒可以檢測多種屬2.這個試劑盒是否可用于貼壁細胞、固定或凍存的細胞、或組織??No.上述樣本的細胞細胞膜都會或多或少受到損害，這樣的樣本建議用免疫熒光技術(shù)(Cat.No.550911)3.是否與細胞表面標記兼容?CD11B/MAC-1LY-71?只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時做2.線粒體水平的檢測激活Caspase9—激活Caspase3—啟動細胞凋亡2.線粒體水平的檢測?凋亡與線粒體膜電位的去極化相關(guān)?BDMitoscreen(JC-1)Cat#55130
5、225tests?JC-1:可穿透細胞膜的親脂性陽離子熒光素?原理：JC-1在正常細胞中以聚合體形式存在于線粒體基質(zhì)上產(chǎn)生紅色熒光（FL-2Channel）；細胞凋亡時，線粒體膜電位發(fā)生去極化，膜電位降低，JC-1以單體形式存在于胞漿內(nèi)，熒光強度減弱甚至消失，故用熒光信號的變化判別凋亡的發(fā)生。p操作簡單，試劑直接加入細胞中，20分鐘后檢測JC-1檢測結(jié)果流式圖JurkatTCellsMouseThymocytesControlControlR1R1R1R2R2R2StaurosporineCamptothecinFasmAbJCR1R1R1-1(Fl-2)R2R2R2
6、JC-1(Fl-1)3.凋亡相關(guān)酶的檢測-Caspase?背景知識–細胞凋亡過程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）–Caspase3是參與DNA維護和調(diào)控細胞的重要組分，即Caspase3激活==細胞凋亡–檢測原理：是通過特異性抗體檢測全長或者剪切后的Caspase活性。Caspase-3data（IHC）JurkatT-Cells6μMcamptothecinfor4huntreatedCaspase-3data（FCM）JurkatT-CellsMouseThymocytesCaspase-3KitsFIT
7、CActiveCaspase-3CatNo.ApoptosisKitFITCActiveCaspase-3550480ApoptosisKitPEActiveCaspase-3550914ApoptosisKitPARPcleaved–Caspase3水解產(chǎn)物?PARPs：一類由DNA鏈斷裂而被激活的DNA修復酶。PARP可以被Caspase-3水解成兩個大小分別為24-和89-kDa的片段而失活?PARPcleaved是凋亡細胞中活化的Caspase-3水解產(chǎn)物，代表Caspase酶失去活性?細胞凋亡的標志PARPcleaved–Caspase3水
